Способ получения содержащего фруктозу продукта из сахарозы Советский патент 1986 года по МПК C07H3/02 

1

Изобретение относится к способу получения продукта, содержащего фруктозу из сахарозы, который находи применение в пищевой и фармацевтической промышпенности.

Цель изобретения - повыщение содержания фруктозы в целевом продукте

Предлагаемый способ обеспечивает полут 1ение фруктовых сиропов, содержащих более 55% фруктозы.

Приготовление 1 является иллюст- рапией типичной процедуры ферментации, проводимой с целью получения желаемого фермента из штамма дрожжей pullularia pullulans. АТСС 9348.

Получение ферментного препарата фруктозилтрансферразы на целитном носителе, Процедура ферментации, используемая для продуцирования указанного фермента.

Среда, используемая для развития посевной культуры (инокулята) и для ферментации с целью продуцирования желаемого фермента, имеет следующий состав,%: дигидрофосфат калия 0,5; хлористый натрий 0,1; гептагидрат серно-кислого магния 0,02; сульфат аммония 0,06; дрожжевой экстракт (производства фирмы Дифко Лаборато- риз) 0,3; сахароза (пищевого сорта) 7,5. рН среды доводят до 6,8.

Посевные колбы (500-миллилитро- вые колбы Эрлемейера, содержащие too мл стерильной среды указанного состава) засевают исходной культурой черных дрожжей pullularia pullulans, на скошенном агаре. Для этой цели используют щтаммы этих дрожжей, который обозначен в каталоге под названием Коллекция типовых культур США (Роквилл, Мэриленд, American Туре Cneture collection) как штамм АТСС 93А8. Эти посевные колбы (после вьщерживания их на качалке возвратно- поступательного типа в течение 48 ч гфи 32°С) используют для инокуляции 1-литровых эрленмейеровских ферментационных колб, каждая из которых содержит 200 мл среды указанного состава. При этом .используют концентрацию посевного материала (инокулята), равную 0,5% (масса/обьем). Ферментацию проводят на качалке возвратно- пос1 упателы1ого типа в течение 7 дн. при 32 с;,

Vl3B.ne4eHne фермента из ферментационного бупьона.

304692

Ферментационные бульоны из сорока 1-литровых встряхиваемых на качалке колб объединяют вместе, освободившиеся колбы ополаскивают водой и эти

5 промывные воды тоже присоединяют к объединенному ферментационному бульону. Конечный объем бульона после разбавления составляет 12 л. Первоначальный объем ферментационного бульо10 на равен приблизительно 8л. 12л ферментационного бульона пропускают через непрерывную центрифугу типа шарплес с целью удаления дрожжевых клеток и клеточных остатков. К полу15 ченному супернатанту, который представляет собой черный вязкий раствор, прибавляют затем хлористый кальций до концентрации 0,5% (масса/ объем) и рН полученного, раствора до20 водят до. 7,0 с помощью гидроокиси натрия. Затем эту систему вторично пропускают через центрифугу типа шарплес 5 получая в итоге вязкий супернатант, имеющий незначительную

25 по интенсивности окраску. Величину рН эт.го обесцвеченного супернатан- та доводят соляной кислотой до 5,5 и затем вносят 1000 ед пуллюланазы. Получаемый при этом бульон консерви30 руют с помощью толуола (добавляемого до насыщения) и пуллюланазу оставляют реагировать при температуре окружающей среды на ночь. После фер- ментолиза пулл)оланазой в течение ночи

35 в бульоне суспендируют 1% (т.е. достаточное для образования суспензии 1%-ной концентрации) целита Графко № 503, Gretco № 503 Celite производства фирмы Дзонс Манвилл Продактс

40 Корпорейшн, Ломпок, Калифорния и затем добавляют туда же 2 объема (24 л) ацетона. При этом образуется осадок, который собирают фильтрованием, фильтр-прессную лепешку промывают на

45 фильтре ацетоном и сушат при температуре окр-ужающей среды. Собранный на фильтре осадок (фильтр-прессная лепешка) содержит переведенный в нераст-/:. воримое состояние (иммобилизованный)

5Q фермент фруктозилтрансферразу.

В приготовлении 1 следует обратить внимание на то, что прибавление хлористого кальция к ферментационно- му бульону и доведение рН бульона до 7,0 приводит к удалению черного пигмента и присутствующих в бульоне кисльпс полисахаридов.

Благодаря указанной обработке целевой ферментный продукт получается в виде сравнительно чистого бесцветного препарата. С помощью этого метода обеспечивают целевой ферментный препарат, не содержащий нежелательны пигмент и кислые полисахариды, которые образзтотся в качестве побочных продуктов в процессе ферментации и, если их не удалить своевременно, со- осаждаются с ферментом при добавлении к ферментационному бульону раст- ворителя (ацетона).

В качестве дополнительной меры очистки при вьщелении очищенных фер- .ментных препаратов желательно удалить из ферментационного бульона пуллюлановый полисахарид, неизбежно присутствующий в нем, вследствие того, что этот полисахарид тоже будет соосаждаться с ферментом фруктозил- трансферразой при добавлении растворителя к ферментационному бульону. Поэтому супернатант, полученный в результате обработки.ферментационного бульона хлористым кальцием и доведения рН до 7,0 гидроокисью натрия, может быть подвергнут дополнительной обработке известным гидролизующим ферментом пуллюланазой. Фермент пул- люл§наза беспорядочно гидролизует пуллюлан с образованием низкомолекулярного полимера, что позволяет избежать соосаждения и, как следствие этого, загрязнения ферментного препарата фруктозилтрансферразы в процессе обработки бульона органическим

растворителем (например, ацетоном, этиловым спиртом и т.д.).

Фруктозилтрансферразные ферментные препараты могут быть использованы и без удаления пуллюлана.

Эксперимент 1. Получение вторичного субстрата при исполь-. зовании фермента фруктозилтрансферразы на пуллюлановом носителе.

К 20%-ному раствору сахарозы, забуференному 0,05 М цитратным буфером с рН 5,5 прибавляют 1 мас.% су-, хого пуллюлака, полученного в соответствии с методикой приготовления 1 с той разницей, что пуллюлан не гид- ролизуют пуллюланазой, а оставляют в истеме качестве носителя фермента руктозилтрансферразы. По этой причине е используют целит, который вносят в бульон после его обработки пуллюланазой в качестве носителя в примере 1 . Активность ферментного препарата фруктозилтрансферразы, полученного в соответствии с такой видоизмененной методикой, составляет 677 е на 1 г пуллюлана. Реакцию пррводят при температуре окружающей среды до тех пор, пока смесь не помутнеет. Образец этого материала анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и получают в итоге следующие результаты.

Углеводный (сахаридный) состав смеси, вычисленный по результатам анали за методом жидкостной хроматографии высокого давления,%: фруктоза 6,9; декстроза 40,6; ДР 6,2;

полимеризации

flPj П,1; ДР 35,2, ДР означает степень полисахарида.

Эксперимент 2 дополнительно характеризует фермент, полученньй согласно приготовлению I,

Эксперимент 2. Эксперимент 1 относится с трансфруктози- лазации с использованием первичного субстрата, в котором содержание сухого вещества исходной сахарозы не превьшает точку насыщения при данных условиях реакции. Эксперимент 2 показывает использование первичного субстрата с начальной концентрацией сахарозы выше насыщения, который под воздействием фермента фруктозилтрансферразы дает продукт, содержащий по- вьшенные уровни материала ДР (т.е. фруктозилсахарозы) и пониженную концентрацию продуктов ДР. Кроме того, показано увеличение концентрации сухого вещества (в мае. отношении).вто- :ричного субстрата по сравнению с концентрацией сухого вещества, полученного при отсутствии ферментов фруктозилтрансферразы. Кроме того, показано, что с понижением концентрации сухого вещества полимера фруктозы во вторичном субстрате материал ДР присутствует в незначительных количествах. Это отличается от результатов эксперимента 1 с исполь- зованиеМ субстратов сахарозы на уровне ниже точки насыщения. В этих примерах ДР является первичньм продуктом.

Приготовление вторичного субстрата из шламов сахарозы вьппе точки на- сьщения.

Пищевую сахарозу в виде 200 г аликвот помещают в 1-пинтовые склянки с завинчивающейся пробкой. В качестве контроля в одну склянку добавляют 50 мл воды, а в другие - 50 мл воды, содержащей увеличивающиеся количества фермента фруктозил- трансферразы - препарат Селит (получен согласно приготовлению 1). Каждую склянку закрывают пробкой и помещают во встряхиваемую водяную ванну при 54-55°С. Склянки встряхивают в течение 24 ч при периодическом ручном перемешивании. Образец

Хотя в эксперименте 2 использовалось 200 г сахарозы на :50 мл воды., т.е. 80 мас,%-ное соотношение, концентрация сухого вещества исходного вещества сахарозы может быть увеличена . ,

В примерах 1 и 2 при изомеризации „декстрозы во фруктозу используют им304696

надосадочной жидкости удаляют из каждой склянки и помещают в испытательной колбе с завинчивающейся пробкой в ванну с кипящей водой для 5 инактивации фермента. Затем эти образцы анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и определяют сухое вещество в надосадочной жидкости (способ Фишера).

Результаты исследований представ- лень в табл. .

Т а б л и ц а 1

мобилизованн то глюкозоизомеразуэ которую иI lмoбилизyют по след5гющей методике .

Носитель из пористой окиси алюминия дважды промывают водой и при перемешивании инкубируют в течение I ч с Ojl М цитратом натрия, -который .вымывают из носителя до тех пор.

7

пока проводимость промывных вод не достигнет 1000 . Носитель инкубируют с 0,05 М хлоридом магния в течение 1 ч, после чего раствор хлорида магния декантирзпот.

Добавляют такой объем 0,05 М хлорида, магния, чтобы получить результирующую концентрацию фермента, равную 400 ед./мл, Концентрат глюкозоизоме- разы (ксилозоизомераза 5,3.1.5), полученный с помощью Streptomices olivochromogenes АТС 21715, прибавляют к носителю в концентрации 14 мл. ед. на 1 ф (около 28,4x10 см) , Носитель и фермент вьщерживают в контакте 22-24 ч, после чего несвя- завщийся фермент отмывают с носителя дистиллированной водой.

Полученный таким образом иммобилизованный фермент загружают в стеклянную колонку с рубашкой (3x18 см), снабженную насосом соединенным с подающим питающим резервуаром. Основной объем колонки после загрузки равен 45 мл.

Пример 1. Сахарозу пищевой чистоты (600 г), растворяют в воде до общего объема 800 мл, рН этого раствора доводят до 5,5 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Сухую рецептуру цеолитфермент (dnulpsucrase 2.4.1.9), 11 г, имеющую активность 550 ед/г и ную согласно эксперименту 1, суспенФруктоза 2,4

ПР.

ДР,

Ц

30469В

дируют в 100 мл воды. Суспензию отфильтровывают под вакуумом на воронке Бюхнера с использованием фильтра из бумаги ватман № 1. Осадок на фильтре

5 дополнительно промывают 100 мл воды. После этого 200 мл фильтрата прибавляют к раствору сахарозы, который помещают в сосуд емкостью 1,89 л, снабженный завинчивающейся крьшкой.

10 Затем сосуд помещают в водяную баню с температурой 58°С и проводят реакцию в течение 20 ч. Реакционный продукт содержит смесь декстрозы, фруктозы и полисахаридов, содержащих не менее

15 чем 66 мас.% фруктозильных остатков, причем фруктозильные остатки связаны (2-) -связью.

Состав углеводов следующий,%: фруктоза 2,4j декстроза 32,8;

20 ДР 10,6; ДР. 22,9; ДР,31,3.

После этого к продукту реакции прибавляют хлорид магния концентрацией 5 ммоль/л и рН доводят до 8,4 добавлением разбавленного раствора

25 гидроокиси натрия. Затем эту смесь Подвергают действию глюкозоизомеразы (ксилозоизомераза 5.3.1.5), иммобилизованной на пористойокиси алюминия в колонке (иммобилизованнзто изо30 меразу получают по указанной методике) при 60°С и рН 8,4. Определяют углеводный- состав продукта, собранного из колонки.

Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

62,4

36,2

О

0,5

0,9

После этого продукт подвергают действию очищенного инвертазного фермента, полученного из Candida utilis при соотношении 10 мг фермента на 100 мл продукта, и проводят реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Образец продукта анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления, а с оставшимся продуктом проводят реакцию еще в течение 6 дн. после анализа. Конечный продукт содержит 62,4% фруктозы, в то время как обычная инверсия сахарозы обработкой инвертазным ферментом дает продукт, содержащий 50% фруктозы.

I Пример 2, Сахарозу пищевой чистоты (600 г) растворяют в воде С получением общего объема 800 мл, рН этого раствора доводят до 5,5 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Сухую рецептуру цеолит- фермент (dnulosucrase 2.4 . ) , 9) ,. 11 г , имеющую активность 550. ед/г и полученную по эксперименту 1, суспендируют в 100 мл воды. Суспензию отфильтровывают под вакуумом на воронке Бюхнера с использованием фильтра из бумаги ватман № 1. Осадок на фильтре дополнительно промывают в 100 мл воды. После этого 200 мл фильтрата прибавляют к раствору сахарозы, находящемуся в сосуде емкостью 1 ,89 л с завинчиваюодейся крышкой. За тем сосуд помешают в водяную баню с

Фруктоза2,4

Декстроза32,8

ДР,10,6

.OPj22,9

ДР..

31,3

69;о

температурой и проводят реакцию в течение 20 ч. Продукт реакпии содержит смесь декстрозы, фруктозы и полисахаридов, содержащих по крайней мере 66 мас.% фруктозильных остатков, причем фруктозильные остатки связаны () р.-связями. Определяют состав реакционного продукта.

Затем в реакционный продукт прибавляют хлорид магния в концентрации 5 ммоль/л, рН доводят до 8,4 добавлением разбавленного раствора гидроокиси натрия. Затем эту смесь подвергают действию глюкозоизомеразы (ксилозоизомераза 5.8.1.5), иммобилизованной на пористой окиси алюминия в колонке (иммобилизованную изомеразу получают по указанной методике) при температуре 60°С и рН 3,4. Определяют углеводный состав проду1 :та,, собранного из колонки. К этому продукту прибавляют серную кислоту концентрацией 0,05 и. Смесь нагревают до 75-80°С и.проводят реакцию в течение 2 ч. Через 1-2 ч проведения реакции отбирают образцы и провоДят их анализ на углеводный состав с помоЕуью жидкостной хроматографии высокого давления. Результирующий продукт содё1|йкит приблизитель-. ко 60% фруктозы. Обычн а я .| ;нверсия сахарозь обработкой инверягазньш ферментом дает продукт 5 содержащий 50% фруктозы.

Результаты исследований представлены в табл. 3 ,

Т а б ,л и ц а 3

1-1 -123046912

tl р и м е р 3. Продукт, получен-Пример 4. Продукт, полученный после обработки ксилозоизомера-ный после обработки ксилозоизомера- зой 5.3.1.5 по примеру 1, подверга-зой 5,3.1.5 по примеру 2, подвергают ют гидролизу инвертазой (полученнойгидролизу разбавленной соляной кис- из Pfansteihl Laboratories, Wauke-5 лотой при 70 - 80 С. Гидролиз gan, Illifnois) с использованиемдля фруктозы и глюкозы завер- 0,1 мл инвертазы на 10 мл раствора.шают приблизительно через Гидролиз для фруктозы и глюкозы за-i 4, вершают через 48 ч.