Штамм коронавируса Lp (Ленинград)2/77 для диагностики коронавирусной инфекции Советский патент 1988 года по МПК A61K39/215 C12N7/00 

С0

( со ел Изобретение относится к области медицинской вирусологии и может быть использовано для приготовления коронавирусного диагностикума. Предложенный штамм новый в патент ной и научно-технической литературе не описан. Целью изобретения является получе ние высокопродуктивного штамма для диагностики коронавирусной инфекции. Предлагаемый штамм получен из эта лонного путем длительной его адаптации к условиям культивирования в органной культуре из трахеальной ткани плода человека и в диплоидной культу ре клеток из легочной ткани эмбриона человека. Продолжительность адаптации штамма к клеткам различного происхождения составила 209 дней. Штамм коронавируса Lp (Ленинград/ /2)77 для диагностики коронавирусной инфекции хранится в Государственной котшекций вирусов Института вирусоло гии им. Д.И.Ивановского Лод номером ГКВ-1770. Штамм характеризуется следующими ..признаками. Морфология. По данным электронномИлсрос1сопических исследований варионы имеют диаметр от 80 до 160 нм. Структура вариона достаточно полиморфна. Варионы i-MeioT шаровидную, округлую, эллиптическую, иногда слег ка изогнутую .форму и покрыты отростками длиной 15 нм, образую1цими ореол вокруг вирусных частиц. Репродукционная активность. Штамм характсри- уется высокта и показателями репродукционной активности в куль туре клеток легочной ткани плода человека. Инфекционньм титр равняется 6,0 1вИД5 /м. В условиях адаптации к размножению в органной культуре из трахеи плода человека штамм обладаат способностью подавлять мерцательную активность клеток реснитча того эпителия на 75%. Сравнительный анализ инфекционной активности эталонного и диагностичес кого штаммов коронавируса показал, что предлагаемый штамм относится к категории высокоурожайных вирусов. Это подтверждается результатами определения титров вирусов на культурах различного происхождения. .Так, диагно( гический штамм имеет следующие пока; гели инфекционной активнос ти; в клетках органного эпителия человека 5,5 Ig в диплоидных клетках легочной ткани плода человека 6,0 Ig ИДуд/мл и в первичной культуре клеток из легкого плода челове- Ка - 3,5 Ig ИДу|,/мл. Эталонный штамм либо не размножается на указанных тканевых культурах, либо репродуцируется, но в крайне низких титрах. Из-за крайне низкой репродукционной активности эталонный штамм вообще Нельзя использовать для серодиагнгстики коронавирусной инфекции. Предлагаемый штамм отличается достаточной активностью по отношению к антителам человеческих сывороток.. Средние геометрические титры при использовании штамма в реакции нейтрализации (РН) на тканевых культурах колебались в пределах от 4,3 до 13,9, а в реакции связывания комплемента от 4,,О до 6,1. Среди обследованных доноров процент серопозитивньгх лиц к указанному вирусу составляет соответственно 70,5-81,1 в зависи 1ости от методов серологического обследования. Резистентность к ингибиторам. Промежуточный вариант коронавируса шт. LP (Ленинград/1)77 является достаточно чувствительным к широкому спектру ингибиторов сывороток человека и сивотных. Максимальные показатели индексов ингибиции сывороток варьируют в значительных пределах от 30 до 3162. Полученньй ингибиторорезистектный вариант из популяции ингибиторочувствительного штамма становится резистентным к неспецифическим ингибитором сывороток человека, морской свинки, лошади, телят и хомяков. Специфичность диагностического штамма. Специфичность диагностического штамма показана в реакции нейтрализации на тканевых культурах с помощьй использования типоспецифических сывороток. Известная сыворотка в разведении 1:128 ингибирует 100 доз вируса. Использование ингибиторорезистентного штамма Lp (Ленинград/2)77 . коронавируса иллюстрируется следующим примером. Пример. Шточный материал вируса Lp (Ленинград/2)77, прошедший контроль на стерильность, специфичность, биологическу о активность (инфекционную, цитоксическую) резистентность к неспецифическим ингибиторам сывороток человека и различного вида животных, разводят в 100 раз на поддерживающей среде Игла (рН 7,2), содержащей антибиотики (пенициллин 200 ед/ /мл, стрептомицин 100 мкг/мл). Объем разведенного вируса составляет 100 мл Комплемент связывающий антиген ви руса готовят в диплоидной культуре клеток легочной ткани плода человека Матрицы с клеточной культурой (пробы 20, 21, 22) заражают полученным разведением вируса. Доза заражения соетавляет 10 . После 2-часово го контакта вируса на клетках культу ру несколько раз промывают фосфатносолевым буферным раствором (рН 7,2) Зараженные клетки инкубируют в термо стате при температуре 35-36°С в тече ние 4-5 дней до наступления характер ных деструктивных изменений клеток. Вируссодержащий материал подвергают 3-кратному замораживанию и оттаиванию в смеси сухого льда со спиртом. Собранную жидкость центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин для удаления клеточного детрита. Поддерживающая среда при выращивании- вируса состоит из среды Игла с добавлением 1% раствора бычьего альбумина и антибиотиков . Полученный материал (пробы 20, 21 22) проверяют на присутствие инфекционного вируса путем титрования воз будителя в диплоидной культуре клеток легочной ткани плода человека при . В пробах из матрицев 20, 21, 22 инфекционный титр равен 6,0, 5,5,6,0 Ig . Все пробы (NN 20, 21, 22) специфичны, так как нейтрализуются типо- специфической гомологической сыворот кой до титра 1:128. Вирусный матери ал контролируют на чувствительность к неспецифическим ингибиторам сывороток человека и животных в реакции нейтрализации на .клетках легочной ткани плода человека. С этой цепью 10-кратные разведения вируса соединя ют с падающими 2-кратными разведения ми сывороток (человека, морской свин ки, лошади, телят, хомяков). После 2-х часового контякта при комнатной температуре смеси вносят в пробирочные культуры клеток легочной ткани эмбриона человека (ЛЭЧ), которые культивируют при температуре 36 С. Ингибирующую активность сывороток вьфажают в индексах ингибиции (в 9 1 антилогарифмах разности титров вируса в опытных и контрольных культурах) . Все (20, 21, 22) оказались резистентными к ингибиторам сьгоороток человека и животных. Комплементсвязывающим антигеном вируса служит осветленная вирусосодержащая культуральная жидкость. Подготовленные и проконтролированные на стерильность, специфичность, биологическую активность и ингибиторезистентность антигены подвергают лиофилизацин. Для этого в каждую бутыпь, содержащую 100 мл вирусного антигена, добавляют равный объем 13% пентона. Бутьти fr 20, 21, 22 обозначают как серии диагностикума № 1, 2, 3. Затем каждую серию (по 10 мл антигена) разливают во флаконы емкостью 50 мл: по 20 флаконов каждой серии). Сразу по окончании лиофилизации (продолжительностью 40 ч) флаконы перекрывают резиновыми пробками. Полученный антиген (серии 1, 2, 3) повторно контролируют на стерильность, специфичность, биологическую активность, резистентность к ингибиторам сыворотки человека и животных. Инфекционный титр в готовых диагностику1 ах серий 1, 2, 3 составляет соответственно 6,0; 5,5; 6,0 Ig . Диагностикумы по всем указанным вьше контрольным исследованиям отвечают предъявляемым к ним требованиям. Предлагаемый штамм имеет высокие показатели репродукционной активности на тканевых культурах различного происхождения и хорошо зарекомендовали себя в качестве антигена для серологической диагностики коронавирусной инфекции. Так, процент серопозитивных лиц по данньм исследований составляет от 70,5 до 81,1 в зависимости от метода серологического обследования доноров (в РСК или в реакции нейтрализации на тканевых культурах). Предлагаемый диагностический штамм отличается достаточной унифицированностью, так как может быть использован для выявления как комплементсвязывающих, так и вируснейтрализующих антител. Штамм характеризуется высокой экономической эффективность. Для получения высокоурожайного вируса с титром 6,0 Ig ИД If о/мл из эталон5 9249516 ного штамма требуется затратить более 200 дней, а для получения анало-расходованию материалов - 21-кратным, гичного диагностикума из предлагаемо- Использование позволит в FO штамма требуется затратить толькозначительной степени повысить зффек5 дней. Экономический эффект по тру- тивность диагностики коронавирусной дозатратам является 41-кратным, а поинфекции.

Штамм коронавируса Lp (Ленин.град/2) 77 (хранится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.ИвановСКОРО под номером ГКВ-1770) для диагностики коронавирусной инфекции.