364 большой, вполне возможно образование нежелательных цвета и псикозы. Концентрация глюкозы в .глюкозосодержащем растворе должна находиться в пределах примерно от 5 до 80 вес,% и преимущественно от 40 до 60 вес,%, Величина рН глюкозосодержащего . раствора должна находиться в пределах примерно от б до 9, и преимущественно от 6,5 до 8, а еще более желательно от 7 до 8. Очень важно поддержание величины рН глюкозосодержащего раствора в указанных пределах в ходе реакции изомеризации, поскольку если величина рН этого раствора находится ,вне указанных пределов, то изомераза будет быстро инактивироваться и/или будет образовываться большое количест во нежелательных: побочных,продуктов, например окрашенных веществ и псикозы Глюкозосодержащий раствор при 20-. 80° С контактируют с ферментом глюкозо изомеразой путем .пропускания его через 2-12 слоев клеток микроорганизмов внутри которых стабилизирована глюко зоизомераза, при этом каждый слой имеет активность от 3 до 1000 IGlU Ha 1 см слоя, стабильность 50-1200 ч и соотношение высоты слоя к ширине от 0,01 до 2. Величину стабильности определяют путем введения определенного количест ва связанной глюкозоизомеразы в колон ку до достижения активности от 1000 д 4000 IGIU. Через эту колонку пропускшот раствор, имеющий рН 7 и содержащий 3 К . глюкозы, О ,001 М СоСе и 0,005 М MgSOi со скоростью 20-80 мл/час, Температуру в колонке поддерживают равной 60®С« Фракция глюкозы превращаемая в фруктозу в, выходящем пото ке, определяется по прошествии 20 ч, когда слой связанной изомеразы глюкозы находится в условиях равновесия Индекс активности связанной изомеразы глюкозы рассчитывают согласно следующей формуле Индекс активности (R/E) 609- 0,504/ /(0,504-1)./ где 1-фракция глюкозы, конвертированная в фруктозу, R скорость потока, МП/час, и Е - исходное число IGIU в колонке. Индекс активности определяют перио дически, и время, необходимое для того, чтббы индекс активности достигнул половины его исходной величины (величины спустя 20 ч.) представляет собой величину стабильности, выраженную в часах, IGIU - международная единица изомеразы. глюкозы, представляет собой количество фермента, которое превращает 1 мкмоль глюкозы в фруктозу в минуту в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на 1 л 0,02 моль MgSp на 1 л и 0,0.001 моль CoCEj на 1 л при величине рН 6,84-6,85 (0,2 М малеат натрия) и при 60°С, Цвет (или окрашивание) определяют методом спектрофотометрии :по измерению спектральной поглощательной способности при 450 и 600 мк соответственно разбавленной жидкости в 1-сантиметровой кювете, при использовании воды в качестве эталонной жидкости. Для измерения использовали спектрофотометр Бекмана ДК-2Д, изготавливаемый фирмой Beckman Instrument Company. Величину цвета рассчитывают по формуле: цветовые единицы i2lHllo2 6oo), где спектральная поглощательная способность при 450 мк; спектральная поглощательная способность при 600 мк; ,С концентрация, выраженная в граммах сухого вещества на 100 мп жидкости. Содержание фруктозы в изомеризованной жидкости определяют путем измерения изменения удельного вра.щения плоскости поляризации., происходящего в ходе изомеризации. Удельное вращение плоскости поляризации измеряют, используя автоматический поляризатор NPL модели 969, изготовленный фирмой Bendik Corporation, Удельное вращение плоскости поляризации определяют при концентрации 2,5 г/100 МП в стеклянной кювете, . термостатированной при 25°С, Длина кюветы 50 мм. Удельное вращение плоскости поляризации определяют в начале реакции изомеризации после соединения всех ингредиентов глюкозосодержащих растворов Для определения изменения содержания фруктозы измеряют удельное вращение плоскости поляризации изомеризованной жидкости. Величину рН всех образцов доводят до 4fO с помощью разбавленной соляной кислоты для того, чтобы прекратить , ферментативное, действие перед разбавлением с целью определения удельного вращения грюскости -поляризации . Изменение содержания фруктозы рассчитывают, используя форг1улу : fOO(A.-Ac,) чъЩТ где Д - удельное вращение плоскости поляризации изомеризованной жидкости; Ад -- удельное вращение плоскости поляризации глюкозосодержащего раствора перед из омеркзацией. В этой формуле величина (-138,9) представляет собой изменение величины удельного вращения плоскости поляризации, которое.происходит, когда глюкоза полностью превращается во фруктозу. 1Сг1еточное вещество, содержащее свя занную или стабилизированную глюкозоизомаоаэу, поддерживается в водной суспензии, содержащей 0,00i моль хлористого кобапьта на литр , при 58с и р 6,5 (0,05 М буферный раствор малеата натрия), Это клеточное вещество поддерживается при указанных условиях в течение 20 ч. Через часть этой суспензии пропускают ультразвук с час тотсй волн 20 кГ, используя для этого зву кои злу чат ель Брэнсона S,.Подвергнутый обработке ультразвуком материал центрифугируют и центрифугат анализируют на активность глюкозоизомеразы. Другую часть суспензии (не подвергнутую воздействию ультразвука) центрифугируют и определяют активность глюкозоизомеразы полученного центрифугата.Активность экстрагированной глюкозоизомеразы в последнем центрифугате поделенная на активность глюкозоизомеразы в центрифугате материала, подвергнутого ультразвуковой обработке, умноженная на 100, представляет собой коэффициент экстракции обработанного клеточного вещества. Характеристики слоя, содержащего клетки микроорганизмов,, которые подвергаютс.1 обработке для предотвращения экстракции глюкозоизомеразы из клеток, играют чрезвычайно важную роль в отношении качества образующегося фруктово-глюкозного раствора и в отношении промышленного применения настоящего способа. Этот слой должен иметь активность изомеразы глюкозы яе менее 3 IGIU на 1 см . Если этот слой имеет активность изомеразы глюкозы менее 3/IGIU на 1 см % то для изомеризации эквивалентЕ ых количеств глюкозы требуется болышй объем слоя Это может быть связаяо с различными трудностями, такими как повышенный перепад давления по сечению слоя, более продолжительное время контакти рования между глюкозосодержащим раствором и глюкозоизомеразой для получения желаемой, степени превра1«еПИЯ глюкозы в фруктозу,, н повышенвые капиталовложения ввиду большого размера оборудования, необходимого для введения слоя клеток. Кроме то-., го, по мере того, как увеличивается сечение слоя, возникает тенденциям. уплотнению слоя в результате высоких давлений, которые могут использоваться для пропускания через этот слой глюкозосодержащего раствора. Так например, при относительно тонком слое он может улотняться в очень.незначительной степени, в то время как в слое большего сечения уплотнение значительно сильнее. Когда это происходи перепад давления по сечению слоя буд увеличиваться в такой степени что давление, необходимое для прохождени раствора глюкозы через этот слой, бу дет слишком высоким, и может быть та ковым, что обычное оборудование не сможет быть использовано для введения в него этого слоя. Величина стабильности связанной изомеразы глюкозы должна составлять не менее 50 ч, преимущественно 300 ч, более желательно 400 ч. Отношение высоты к ширине (или диаметру) слоя микроорганизмов, содержащих в клетках глюкозоизомеразу, должно быть менее 2, преимущественно 0,01-0,1 и наиболее желательно 0,02-0,05, Высота сечения слоя клеток, содержащих глюкозоизомеразу, должна находиться, например, в пределах 25,4-127 мм. Слои клеток, имеющие указанные размеры, обеспечивают небольшой перепад давления по сечению слоя, и уплотнение этого слоя минимально. Однако, ввиду того, что высота сечения слоя относительно невелика, наблюдается большая тенденция к каналообразованию. Каналообразование приводит в результате к неэффективному испальзованшо изомеразы Г711окозы. Если, по меньшей мере, два слоя и преимущественно не менее шести слоев связанной или стабилизированной глюкозоизомеразы располагаются в последовательные ряды и обеспечивается перемешивание потока,исходящего из предьщущего слоя, перед тем, как он проходит через последующий слой, то любое Каналообразование не будет вызывать серьезного влияния на эффективность использоваЕШя связанной илистабилизированной глюкозоизомераэы. Внутриклеточная глюкозоизомераэа может быть связана или стабилизирована внутри клеток или на поверхности клеток микроорганизмов в результате различных обработок. Так например, клетки могут подвергаться термической обработке при суспензированйи в исходном питательном растворе в ферментере,или при тep мчecкoй обработке после удаления из питательного раствора ферментера. Имеются и другие способы обработки клеток для связывания или стабилизирования глюкозоизомераэы внутри этих клеток. Точный механизм обработки с целью связывания или стабилизации изомеразы неизвестен, но можно полагать, что ферменты клеток, которые вызывают автолиз этих клеток,приводящий к утечке или . экстракции глюкозоизомеразы, инактивируются в ходе этих обработок. Условия обработки основаны на двух критериях: условия обработки не должны быть настолько жесткими, чтобы разрушать или инактивировать значительное количество глюкозоизомеразы, коэффициент экстракции обработанных клеток должен быть относительно низким. Обычно большинство обработок, которые связывают или стабилизируют глюкозоизомеразу, приводят к тому, что часть глюкозоизомеразы инактивируется, В отношении первого критерия обработка должна осуществляться так. чтобы инактивировапось примерно не более 50% глюкозоизомеразы по сравнению с необработанными клетками, преимущественно не более 40%, и наиболее желательно, чтобы инактивировалось не более 15%. Коэффициент экстракции обработанных клеток долже составлять менее 50%, преимущественно менее 20%, и наиболее желательно менее примерно 10%. Препараты глюкозоизомераэы можно разделить на две обширные категории в зависимости от того, являются ли они термически стабильными. Примерами термически подвижных препаратов изомеразы являются такие, которые получены из PseUdomonas hidrophi a и некоторых других микроорганизмов. Для того чтобы при использовании эти препаратов превратить сколько-нибуд значительное количество глюкозы в фруктозу, как правило, в процессе изомеризации требуется присутствие ионов, арсената или фторида. Препара ты тep шчecки стабильной изомеразы.-не требуют, чтобы такие ионы присутствовали в зоне изомеризации для превращения значительных количеств глюкозы в фруктозу. Примерами микроорганизмов, которые способствуют образованию термически стабильных препаратов изомеразы глюкозы, являют ся микроорганизмы, принадлежащие к разновидности Streptomyces. В пред лагаемом способе желательно использо вать термически стабильные препараты глюкозоизомеразы, которые позволяют применять высокие температуры для снижения или полного предотвращения загрязнения слоя микробами. Кроме того, при использовании термически стабильных препаратов глюкозоизомера зы можно успешно осуществлять термическую обработку для связывания (или стабилизации) глюкозоизомеразы. Термическая обработка может заклю -чаться в нагревании клеток, содержащих термически стабильную глюкозоизо меразу, до определенной температуры и поддержание этих клеток при данной температуре в течение определенного периода времени. Температура и продолжительность обработки являются факторами, .зайисящими друг от друга При высоких температурах требуется небольшое время термообработки, а при более низких температурах бол длительное время обработки. Термичес кая обработка должна осуществляться в таких условиях, чтобы при этом раз рушалось не более примерно 50% изоме разы, преимущественно не более 40% .изомеразы и наиболее желательно не более примерно 15%. Обычно, когда клетки, содержащие термически стабильную изомеразу, нагреваются при 6090 С в течение 60-1 мин, то разрушается не более 40% изомеразы. Величина рН среды, в которой происходят обработка клеток, преимущественно примерно 6-9, Оптимальные результаты получают при обработке в интервале тем-, ператур ТО-ВО С в течение 10-20 мин и при величине рН 7-8. В качестве известного оборудования в предложенном способе используют пластинчатый фильтр-пресс. Последний состоит из ряда плоских фильтрующих ; элементов, уложенных в вертикальном или горизонтальном положении в цилиндрической емкости. Эти элементы могут иметь круглое или прямоугольное сечение и фильтрующие поверхности по обеим сторонам. Продольная ось цилиндрической емкости может быть расположена горизонтально или вертикально. Фильтр может состоять из толстой ситчатой пластины (или пластины с отверстиями) , нсзд которой находится фильтрующая среда, например нетканое или тонкопроволочное полотно. Клеточное вещество, содержащее связанную гл окойоизомеразу, может быть суспензировано в глюкозосодержащем растворе, и эта суспензия просачивается через пластинчатый фильтрпресс так, что она равномерно покрывает клетками каждый пластинчатый элемент (каждый лист). Давление, воздействующее на раствор (в случае вертикального расположения пластинчатого фильтр-пресса), будет сохранять клетки на фильтрующих элементах. Затем через пластинчатый фильтр-пресс мож.ет просачиваться глюкозосодержащий раствор, и в то время, когда он проходит через каждый слой клетчатого материала, сопеожашего связанную глюкозоизомеразу/происходит изомеризация Количество образующейся фруктозы зависит от времени, в течение которого раствор глюкозы находится в контакте со связанным ферментом. Точный состав изомеризованного глюкоэосодержсщего раствора изменяется в зависимсюти от точных условий осуществления данного процесса. В таблице представлены основные характеристики изомеривованных глюкозосодержащих растворов, полученных предлагаемым способом . Типичные30-60 10-54 0-50 Предпочтитель30-60 10-54 0-30 Наиболее предпочтительные 30-60 10-54 0-300-0,1 Количество сахаридоз, ристик продукта. В основном состоит из ходе изомеризации для глюкозы. При мер. Использование связанной или стабилизированной изомеразы глюкозы для непрерывного превра1иения глюкозы в фруктозу.. Strepuomyces АТСС 21175 выра1дива1от в аэробной среде в условиях погружения. Величину рН питательного раствора, содержащего клеточное вещество доводят до 7,5 и этот питательный раствор нагревают в течение получаса до 75°С, Эту температуру выдерживают в течение 5 гди.н с целью ...;вязыванчя глюкозоизомеразы с клeткa.да, В этот питательный раствор вводят 3 вес.% мелкозернистого материала, служащего для образования фильтрующего слоя, и затем питательный раствор фильтруют с помощью вра1цЖйщ,егося барабанного вакуумфильтра поверхность которого предварительно покрывают диатомовой землей. Клеточное вещество прокывамт на этом фильтре. Полученный отжатый осадок высушивают в сушилке с принудительным потоком воздуха при температуре воздуха 49°С L течение примерно 3,5 ч, в результате получают высушенный связанный препарат изомеразы, состоящий из клеточного продукта, включающего связанную изомеразу, перемаианную с мелкозернистым материалом; служащим для образования фильтрующего слоя. Коэффициент экстракции высушенного, связанного препа рата иэомеразы составляет 15 %, а ве .личина стабильности 645 ч. 11б кг высушенного связанного пре парата изомеразы перемешивают в течение 2 JMHH, и затем .сусперщирук1.т глюкозосодержащим раствором, включаю щим очищенный гидролизат кукурузного крахмала с величиной рН, равной 7, в котором содержится 60 г глюкозы на 100 МП, 4,5 г мальтозы, кзомальтозы и олигосахаридов на 100 мл, О,OCX мол CoCe,j на 1 л, 0,01 моль MgS04 на 1 л в основном зависящее от желаемых характесолей металлов, которые присутствуют в стабилиза.ции и/или активации изомеразы 0-1,00,1-0,50-2 0-0,051,0-0,2 0-0,05 0,05-0,10-0,03 и 0,006 моль NaHSO на 1 л. Температура глюкозного раствора 65°С. Суспензию пропускают через пластинчатый фильтр-пресс (изготовленный фирмой Fieter Ршар Mfg,Со.Cicero 111), состоящий из 6 фильтровальных элементов, каждый элемент покрыт слоем связанного препарата изомеразы толщиной 25,4-37,7 мм. , Общая активность изомеразы на элементах составляет 1,26 х xlOlGlU, Фильтровальные элементы имеют общую удельную поверхность 6,87 м. Раствор г.пюкозы непрерывно пропускают через фильтр с такой скоростью, что 45% этой глюкозы превращается в фруктозу, Скорость потока постепенно уменьшается по мере того, как снижается активность связанной изомеразы на элементах,так что степень конЬерсии глюкозы в фруктозу поддерживают постоянной, равной 45%. По истечении примерно 40 ч скорость потока, пропускаемого через элементы составляет 3, 7854-10 м мин . По истечении 200 ч скорость потока 1,8927 , и перепа,ц давления по сечению элементов 0,07 кг/см. Окрашивание глюкозосодержащего раствора, входящего в слой, составляет 0,1 цветовой , и окреоливание раствора, выходящего из слоя, составляет 0,02 цветовых единицы. Предложенный способ обеспечивает повышение выхода конечного продукта при использовании минимального количества глюкозоизомеразы. Формула изобретения Способ изомеризации глюкозы во фруктозу, предусматривающий контактирование раствора с вязкостью 0,5100,0 сП, содержащего 5-80 вес.% глюкозы с ферментом глюкозойзомеразой, при 20-80С и рН 6-9, отличаю11 64932812
щ и и с я тем, что, с целью умень-этом кажлый слой имеет активность
шения количества побочных продуктовот 3 до 1000 IGII) на 1 см слоя,
и повыиения выхода целевого продукта,стабильность 50-1200 ч и соотноиение
контактирование указанного растворавысоты слоя к ширине от 0,01 до 2.
с ферментом осуществляют путем про-Источники информации, принятые
пуска его через 2-12 слоев клетокво внимание при экспертизе
микроорганизмов, внутри которых ста-5 i. Патент Франции № 2073697,
билизирована глюкозоизомераза, прикл. С 12 D 13/00, 1971.
