Способ изомеризации глюкозы во фруктозу Советский патент 1989 года по МПК C13K11/00 

Изобретение относится к произ- водству фруктозы путем ферментативной изомеризации глюкозы.

Цель изобретения .- уменьшение образования псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышение содержания фруктозы в растворе.

Способ изомеризации глюкозы во, фр.уктозу заключается в следующем.

В качестве исходного раствора используют раствор, содержащий 40- 50 мас.% глюкозы, например гидроли- . зат крахмала. Предпочтительными являются ферментативные способы получе- кия гидролизатов, содержащих глюкозу.

Наиболее предпочтительными являются способы , которые используют сочетание ферментов, например глюкоами- лазы и фермента, отщепляющего боковые цепи. Особенно предпочтительными являются сочетания ферментов, способных одновременно превращать ожи- женный крахмал в глюкозу плюс фрук тозу, например сочетание глюкоами- лазы, пуллуланазы и глюкоизомеразы. Этот способ дает возможность получить изомеризованные гидролизаты,

.содержащие48% фруктозы и 50% глюкозы в расчете на сухую массу, ко: торьщ идеально подходят для дальнейшего превращения до 53-60% фруктозы по предлагаемому способу. Можно

: также использовать мембранный процесс для удаления полисахарида из

сл ю

ее о

СП С5

см

гидролизата крахмала, получая фракции, содержащие глюкозы,более 99%, что является идеальным исходным материалом для предлагаемого способа. Растворы глюкозы, полученные кристаллизацией из гидролизатов крахмала, также являются исходным материалом,

Глюкозные и/или глюкозо-фруктоз- ные растворы, которые использз мт в качестве исходных материалов, нуж-- но предпочтительно очищатй, на какой- либо стадии их получения во избежание вредного воздействия неуглеводных примесей на глюкозоизомеразу и для минимизации окрашивания во время температурной изомеризации по предлагаемому способу. Можно использовать неочищенные гидролизаты крах мала, однако, при условии, что будут выполнены условия их получения, описанные, в патенте США № 4376824.

В случае использования раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата для предлагаемого способа, можно также использовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризована во фруктозу. Так, например, раствор изомвризованной глюкозы, содержащий вплоть до 52% фруктозы, можно обработать предлагаемым способом для повышения концентрации фруктозы до более желательного уровня выше 52%, и предпрч- тительно до уровней 55-56% и вьппе.

Растворы глюкозы,, содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.% от углеводородов, можно получить известными способами.

В качестве средства для предотвращения избыточного окрашивания во время высокотемпературной изомеризации можно добавить к глюкозно- фруктозному сырьевому раствору вещества, образующие бисульфит. Предпочтительно исключить кислород из всех растворов, которые могут контактировать с глюкозоизомеразой во время высокотемпературной реакции изомеризации для того, чтобы свести к минимуму любое окисление фермента, которое могло бы привести к инактивации..

Глюкозоизомеразу, которую исполь- ззтот в качестве фермента или как источник фермента для химической стабилизации, можно вьзделить из известных микроорганизмов, вырабатывающих

глюкозоизомеразу, включая; Strepto- myces flavorires, Streptomyces- achroiaogenesj &treptcmyces. echinatus, Streptomyces albus, Streptomy- ces wedmorensis, Streptoinyces..pha- rochromogenes,. Streptomyces. bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ven ezuelae Acrobacter acro0 genes, Acrotacter cloacae. Bacillus coagulans. Bacillus megateri-um. Bacillus fructosus, Acetobacter oxy- . daiis a Acetobacter suboxydans, .Acetpr bacter roseus, Acetobacter melanoge5 nus, Lacto baclllus fermenti, Lacto- bacillus brevis, Lactobacillus gavo- nli, Lactobacillus lycopersici, Lac- tobacillus mannitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hid0 rophilia, Brevibacterium pentaamino- acidictmi, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, Paracolo- bactrum aerogenoides. . ,. Кроме того, можно использовать

5 глюкоиЗомеразу,, которую вырабатывают род Nocardia, Micromonospora, . Microbispora, Microellobospora и Arthrobacter streptorayces вид АТСС 2il75, Она является прекрасньм источником глюкозоизомеразы для ис0

5

пользования в предлагаемом способе. Кроме того, можно использовать глю- козоизомеразу, которая обладает стабильностью при относительно высоких тем-. пературах изомеризации, например

глюкозоизомеразу, продуцируемую . Bacillus stearothermophilus, в частности штамм, выбранный из группы, состоящей из Bacillus stearother- Q mophilus АТСС 21365, WRRL В-3680, WREL В-3681 и HRRL В-3682, глюкозоизомеразу, продуцируемую микроорганизмами рода Ampullariella, например Ampullariella digitata,, Mpulla- , riella lobata, Ampullariella compa- nulata И. Mpullariella regularis, глюкозоизомеразу,продуцируемую Bacillus licheniformis, глюкозоизомеразу, продуцируемую Thermophilus,

Кроме вышеуказанных микроорга- нйзмов предлагаемый способ предусматривает использование их мутантов и вариантов. Мутанты-гены глюкозоизомеразы, выбранные для такого, применения, являются такими, которые обес- 5 пенивают получение глюкозоизомеразы,

которая стабильна при повышенных ; температурах, особенно свыше 90 С и предпочтительно вплоть до около

15

., Такие гены можно получить с

помощью обычных методик, которые ис- польззоот для мутаций микроорганизмов, например облучением или с помо- щью химических мутагенов. Б другом варианте вьщеленные гены глюкозоизо- меразы, которые продотируют глюкозо- изомеразу промежуточной термостабильности, так, например продуцируемь е некоторыми штаммами Streptomyces, могут быть подвергнуты мутации in vitro. Выбор соответствуюших генов- мутантов либо в родственные, либо в другие микроорганизмы сопровождает- ся реинтродукцией генов-мутантов, с последующим ростом и репликацией микроорганизма и проверкой термостабильности полученной глюкозоизомеразы.

Предполагается также, что для по- лучения глюкозоизомеразы повышенной термостабильности, подходящей для химической стабилизации и использования в изобретении, можно использовать методику рекомбинантной ДНК, ЕСЛИ аминокислотная последовательность тримерных (третичных) структур глюкозоизомеразы известна, то можно развить повышенную стабильност с помощью точечкьж специфических мутаций в гене изомеразы для получения ферментов, сконструированных для содержания повышенного количества таких аминокислот, которые придают повышенную стабильность структур.

Предполагается, что такие искусственно созданные ферменты должны быть особенно полезны в предлагаемом способе.

Так как г люкозоизомеразу продуци- руют внутриклеточно с помощью тех или иных микроорганизмов, источником глюкозоизомеразы может .быть просто сбор клеток, а затем фермент можно вьщелить из-клеток известными спосо- бами, например клеточньп аутолизисом разрушением ультразвуком, и использовать в ферментаторе обычного известного типа. Предпочтительно, чтобы глюкозоизомеразу или химически стабилизированную глюкоизомеразу можно было иммобилизовать на инертном носителе в соответствии с обычной и хорошоизвестной методикой Материалы и способы, которые исполь- зуют для иммобилизации ферментоВ|хорошо известны. Также предусмотрено присутствие небольших количеств катионов кобальта, марганца и магния

, 5

0 5 О

Q .е Q ,

5

&

и/или водорастворимой соли сернистой кислоты, например сульфита натрия, бисульфита натрия, сульфита магния, и/или бисульфита магния для снижения или ингибирования денатурирования глюкозоизомеразы во время осуществления процесса.

Пеобходимо, чтобы концентрация углеводорода в исходном глюкозосо- держащем сиропе была в интервале 40 - 50% глюкозы по массе.

Необходимо также вести изомеризацию при рН в интервале от около 6,0 до около 7,0 и наиболее предпочтительно между 5 и 6,5. Проведение изомеризации существенно ниже или вьше указанных значент рН приводит к образованию избыточных количеств нежелательных побочных продуктов, напрш ер псикозы; органических кислот, окрашенных продуктов, предшественников окрашенных продуктов, диан- гидридоБ фруктозы и тому подобное.

Бьшо обнаружено, что рН для опти-, мальной активности глюкозоизомеразы заметно снгокается при высоких температурах, .Для глюкозоизомеразы из Streptomyces rubigenosus оптимальная активность наблюдается при рН 8,6- 9,2 при 25°С, рН 6,9-7,5 при 75 С и 5,6-6,2 при 125 Cj т.е. с повышением температуры изомеризации рН изомеризации можно для поддержания максимальной активности фермента и, кроме того, для предотвращения образования побочных продуктов..

Для предлагаемого способа время контактирования предпочтительно ограничено временем, необходимым для достижения конечной концентрации, по крайней мере от около 53 до около 60 мас.% фруктозы в расчете на полное содержание углевода, присутствующего в реакционной смеси. Так как глюкозосодержащий сырьевой сироп может содержать практически одну только глюкозу, т.е. либо мало, либо вовсе не содержать фруктозы, или может содержать .глюкозу наряду с количествами фруктозы вплоть до около 50%, время реакции зависит от природы исходного сиропа..Так эффективным является время контактирования 10-25 мин.

Еще одним необходимым требованием предлагаемого способа в случае использов.ания химически стабилизированного фермента является длитель7152

ность контактирования глюкозосодер- жащего исходного сиропа и химическая стабильность глюкозоизомеразы..

Предпочтительное время контактирования глюкозоизомеразы или химически стабилизированной глюкозоизомеразы и глюкозосодержащего сиропа зависит в значительной степени от рН, при котором проводят реакцию изомеризации. В нижнем пределе интервала рН время Контактирования может быть более длительным без нежелательного разложения глюкозы и фруктозы за счет образования. В верх нем пределе интервала необходимо более короткое время контактирования во избежание образования псикозы и окрашивания. На практике, полное время пребьюания глюкозосодержащего сиропа при или около окончательной температуре реакции оценивается как время эффективного контактирования, так как происходящие реакции разложения Сахаров являются нефермента- тивными и происходят независимо ,от того, контактирует сироп или нет с глюкозоизомеразой в Поэтому, при проведений изомеризации при температуре свыше 90°С важно снизить время, необходимое для доведения сиропа глюкозы до нужной температуры изомеризации (например, смешивая сироп с паром непосредственно перед контактированием с изомеразой), а после достижения нужного уровня фруктозы быстро отделить сироп от активной изомеразы и затем, как .можно быстрее

охладить сироп до температуры менее 90°С, и предпочтительно до темпера- туры менее 70°С. Если используют растворимую форму глюкозоизомеразы или химически стабилизированной глюкозоизомеразы, необходимо ее инакти- вировать (например, снижением рН до предела, при котором происходит ин- активирование изомеразы) перед стадией, охлаждения во избежание обратного превращения в глюкозу фруктозы, образовавшейся на стадии высокотемпературной изомеризации, так как реакция изомеризации является, естественно, обратимой.

Максимальная степень конверсии глюкозы во фруктозу, которой можно достичь,, определяется термодинамическим равновесием между глюкозой и фруктозой, которое, в свою очередь зависит от температуры, при которой

8

проводят изомеризацию. Очень тщательный анализ равновесных смесей глюкозы и фруктозы приводит к следующей взаимосвязи

F 100 К (к +1); (1) 755

Т + 273

+ 2,3005, (2)

где F - % фруктозы при равновесии

в расчете на полный вес глюкозы и фруктозы;

Т - температура проведения реакции изомеризации;

К - константа равновесия глюкозы от фруктозы.

I

Реальное время контактирования между глюкозосодержащим сиропом и изомеразой в реакторе можно в об- щем оценить путем сравнения следующей формулы, если используют реактор содержащий иммобилизованную форму изомеразы

Fe - FO t ,

КА.

(3)

JQ 15 20 25 30

35

Q -с

. ;

где t - действительное время контактирования;С - концентрация глюкозы и

фруктозы;

У - свободный объем жидкости . в слое насадки (объем слоя минус объем, занимаемый частицами иммобилизованного фермента); F - доля фруктозы в глюкозе

(фруктозиой смеси при равновесии при температуре изомеризации) ;

Fg - доля фруктозы (в расчете на Г + Ф) при поступлении в слой насадки;

F - доля фруктозы (в расчете на Г Ф) в растворе, находящемся в слое насадки; К - константа скорости реакции изомеризации в условиях изомеризации; А - активность изонеразы в слое

насадки.

Значения К для иммобилизованной изомеразы, полученной в соответствии с приведенными далее примерами, нахо- дятся в интервале от около 0,07 до около 5 г. IGIU при температуpax от 90 до соответственно. Это соотношение показывает необходимость .минимизации времени контактирования при высоких температурах при использовании слоев насадки с высокой активностью на единицу объема. Слои насадки, -полученные по способу, описанному в дальнейших примерах, могут, содержать вплоть до 2000 i/ . IGIU/мл, что может привести к достижению 99,5%-ного равновесного содержания фруктозы за менее, чем 1 мин в высокотемпературном реакторе, когда используют постадийные реакторы при различных температурах, и сырье подаваемое в первый реактор, изомери- зугот при низкой темперйтуре перед изомеризацией при высокой температуре во втором реакторе. Когда используют систему постадийньтх реакторов, предпочтительно использовать способ ферментативного превращения глюкозы во фрзгктозу, который включает контактирование глюкозосодержащего исходного сиропа, содержащего от 40 до 50 мас«% глюкозы, с глюкозоизомера- зой при температуре от 20 до 80°С, при рН от 6,0 до 9,0 и времени контактирования от 0,5 до 2 ч для превращения от 40 до 45 мас.%; присутствующей в сиропе глюкозы во фруктозу, повышая температуру изомеризационной среды . от 90 до , устанавливая нужное значение рН изомеризационной среды Biинтервале от 6,0 до 7,0, осуществляя контактирование фруктозосодержашёго сиропа с глюко- зоизомеразой в течение дополнительного промежутка времени от 10 до 25 мин для повышения степени конверсии от 53 до 60 мас.% глюкозы, находящейся в исходном сырьевом глюко- зосодержащем сиропе, причем практически без образования псикозы или других Сахаров, которые не являются глюкозой или фруктозой. Поэтому, использование высокоактивных слоев насадок может привести к малым эффективным промежуткам времени контактирования, которое, в свою очередь, минимизирует разложение фруктозы, которое происходит при высоких температурах, необходимых для проведения предлагаемого способа.

При выборе методики иммобилизации глюкозоизомеразы предпочтительно, чтобы использовались способы, которые дают возможность получать мел

10

15

3056. 10

кие пористые частицы катализатора с тем, .чтобы ингибированне эффектов диффузии изомеризации было минимальным .

В другом варианте нзомеразу можно иммобилизовать в порах мембраны, через которую пропускают раствор г.пю- козы во время высокотемпературной изомеризации, как.средство промоти- рования хорошего контакта между ферментом и субстратом, минимизируя диффузионные ограничения. Носитель, которьй. используют для иммобилизации, является предпочтительно, полностью нерастворимым и инертным для того, чтобы избежать образования нежелательных примесей- или разложения глюкозных (фруктозных) компонентов растворов субстратов,.

Однако, в коммерческой практике,, содержащие .фруктозу сиропы не изготавливают из чистой глюкозы. Чаще в качестве источника глюкозы используют гидролизаты крахмала. Они постоянно содержат сахариды,.отличные от глюкозы и фруктозы (здесь и далее именуемые полисахаридами), ко торые получаются в результате неполного гидролиза крахмала и обратного превращения глюкозы. Обычно они составляют от 3 до 8% в расчете на сухую массу в виде сахаридов, полученных гидролизом крахмала. Поэтому необходимо при оценке температуры, при которой следут проводить изомеризацию, учесть все полиса-хариды, содержащиеся в глюкозном сиропе, также как и другие факторы, как полный вес фруктозы в сухом виде, который должен быть достигнут, образование псикозы и других продуктов, которые не являются глюкозой или фруктозой, во время эффективного времени контактирования сиропа глюкозы и изомера- зы. Уравнения для расчета температуры изомеризации приводятся ниже:

20

25

30

35

40

45

50

- 273; (4) (5) (6)

где т -.температура изомеризации,

V- )

F - равновесное содержание фруктозы (% в расчете на

и

полцое содержание глюкозы + фруктозы) при температуре Т; М - % фруктозы в расчете.на сухую массу требуемый в продукте изомеризации; С - % псикозы + других продук-ч тов разложения, образующих- ся во время эффективного изо- меризационного времени кон тактирования;

Q - % равновесия, .достигнутый во время реакции изомеризации;Р - % содержания полисахарида

в глюкoзнo f сиропе Обычно, менее i%, предпочтительно менее 0,5%, псикозы и других продуктов разложения может образовываться, и позтому может быть достигнуто 99,5% равновесия. Поэтому для получения сиропа, содержащего 5555% фруктозы (s расчете на сухую массу), необходимы следующие температуры изомеризации для глюкозного сиропа указанной концентрации полисахаридов;

ы в сиы, % в сухую

Температура изомеризации,

°С. ,

95,7 99,1 104,3 108,9 113,8 124,3 136,1

Приемлемая коммерческая продукция содержит, в среднем, 55,5% фруктозы в расчете на сзтхую массу. Это так, noTOirty что при этом уровне фруктозы получают кукурузньй сироп с высоким содержанием фрзпктозы, одинаковой сладости с сахарозой по массе в расчете на сухую массу. Кроме того, сироп с содержанием фруктозы 55,5% принят как коммерческий продукт, который используют взаимозаменяемо частично илц полностью вместо сахарозы во многих пищевых продуктах и особенно в газированньк... мягких напитках, ..

Из-за сложностей, сопровождающих поставку, хранение, измерение и включение сиропа в пищевые продукты5 существует общая потребность в установлении стандарта для продуктов.

10

-

is

23056 12

полученных от разных изготовителей, с тем, чтобы продукты из разлизных источников можно было использовать взаимозаменяемо и одновременно. Поэтому уровень фруктозы 55-56% в расчете на сухую массу приобретает особое значение как целевой уровень в технологии, связанной с изготовлением сиропа,

В соответствии с предлагаемым способом можно получать уровни фруктозы по крайней мере 5.3%, предпочтительно по крайней мере 54% и более предпочтительно по крайней мере 55%,

Продукт, полученный по этому способу, характеризуется также приемлемой окраской, которая, естественно, очень желательна, так как это снижает затраты на очистку.

Учитывая указанные требования рН и времени контактирования-)известный способ изомеризации глюкозы можн© соответствзтощим образом приспособить к работе при температуре от около 90 до 115°С и предпочтительно от около 100 до около 110°С для получения высококонцентрированных глюкозо-фрз ктознь х сиропов.

При желании с учетом использова- НИН раствора, содержащего только глюкозу в качестве субстрата для предлагаемого способа, можно также исдользовать раствор глюкозы, в котором часть глюкозы уже изомеризо- вана во фруктозу. Так, например, раствор изомеризованной глюкозы, содержащий вплоть до 50% фруктозы, можно обработать в соответствии с предлагаемым способом, для повьппе- ния концентрации фруктозы до более желательных уровней выше 50% и предпочтительно до уровней 55-56% и ( вьше.

25

30

35

Растворы глюкозы, содержащие фруктозу в количествах менее 50 мас.% углевода, можно получить известными способами.

Учитывая вышеизложенное требование к концентрации гJюкoзы, рН и времени контактирования, известные способы изомеризации глюкозы можно соответствующим образом приспособить для работы в интервале температур от около 90 до около П5 С,предпочтительно между около 100 и около ПО С, для получения сиропа с высоким содержанием глюкозы-фруктозы.

Термостабильность глюкозоизомера .зы может быть существенно повьшена за счет одной или более химических обработок фермента с сохранением его приемлемой активности. Обрабо- тайный таким образом фермент называют химически стабилизированной изомеразой,.

I Химическую стабилизацию изоме- |разы осуществляют рядом различных способов, которые могут привести к повышению термостабильности. Основное достижение состоит во введении структурных элементов в молекулу фермента таким образом, чтобы фермент был устойчивым к раскрытию при нагревании выше его обычной точки термоденатурирования. Предпочтительным способом для осуществления этого является модификация фермента химическими замещениями на нем фрагментов, содержащих поли- меризуемые винильные группы, таким образом, чтобы последние были прочн присоединены к поверхности молекулы фермента в нескольких местах. После этого модифицированный фермент смешивают с одним или более полимеризу ёмыми,винильными соединениями в водных растворах и полученную смесь со- полимеризУют до образования химически стабилизированного фермента, в котором фермент прочно связан во многих точках с трехмерной полимерной матрицей, которая образовала структуру, соответствующую по форме структуре фермента.

Важно при проведении вышеописанных реакций, чтобы условия, которые приводят к денатурированию изомеров с последующей потерей активности, бьши обойдены. Так например, следуе избежать экстремальных значений рН температур во время JBo6b X манипуляций, необходимых для проведения вы- шезгказанных реакций.

Примерами реагентов, которые используют для модификации изомеразы для замещения полимеризуемых ванильных групп на ней, являются акрило- хлорид, метакрилохлорид, акролеин, кротоновый альдегид, малеиновый ангидрид, 3,4-эпоксибутен, 2,3-эпокси пропид сложный эфир акриловой кислоты, 2,3-тиоглицидиловЫй сложный зфи акриловой кислоты, 1.-аллилокси-3(К- этш1енимин)-2-пропанол, 0-сукциними довьш сложный эфир акриловой кисло0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ты, ангидрид хлормалеиновой кислоты, азид малеиновой кислоты, 3-бромпро- пен и аллилнзотиоцианат. Такие соединения могут взаимодействовать со свободными аминогруппами изомеразы, например эпсилонаминогруппой дизино- вого фрагмента.

Другие соединения, которые могут взаимодействовать со свободными группами карбоновых кислот ийрмеразы, могут быть использованы для замещения легко полимеризуемых винильных фрагментов на ней.

Примерами винильных соединений, которые можно сополимеризовать с мрдифициро ванной изомеразой, являются акрилат натрия, метакрилат натрия, акриламид, оксиэтилметакрилат, акрилоилпиперидин 4-спиро-2 -(1, 3- диокмакрилопентан), 1-акрилоил-4- пиперидин и акрилоилметоксиамин. Обычно, предпочтительными являются растворимые мономеры или смеси мономеров, которые дают в результате водорастворимые полимеры.

Обычно бифункциональные виниловые соединения включают в смесь мономеров -для введения сшивающих центров, .что приводит к тримерной полимерной сетке. Подходящими соединениями являются W,N -метокси-бис-акриломид и этиленгликольдиметакрилат. Если используют эти соединения, полимеризу- емая смесь образует нерастворимый гель, который приводят к иммобилизации изомеразы.

Системы инициаторов, которые обычно исггользуют при полимеризации винильных групп, могут быть персульфатом аммония плюс бисульфат натрия,1 перекись водорода плюс сульфат железа, сульфат калкя njnoc N,N,N jN -тетраметштэтилендиамин и рибофлавин.

В другом варианте нековалентное присоединение к трехмерной полимерной матрице может быть достаточным для придания нужной жесткости молекуле изомеразы, и тем самым осуществления заметного повьшзения термостабильности. Это может произойти,- если изомеразу механически включают в сщитый полимерный гель. В этом случае нет необходимости в том, чтобы модифицировать изомеразу присоединением к ней. винильных групп перед .стад.ией полимеризации. Однако, концентрация геля должна быть выше.

чем около 30 мас.% перед тем, как произойдет заметная стабилизация и предпочтительная концентрация геля около 50%. Требуются мономеры, способные образовьшать по лимерные ге- йи, которые могут образовывать электростатические и водородные связи с изомеразой, как, например, акри- лат натряя, метакрилат натрия, акри амид и оксиэтшшетакриЛат.

Третьим способом отверждения изомеразы является внутримолекулярная сшивка, которая может повысить термостабильность.

Нодходящие сшивающие агенты для использования в изобретении включают бифункциональные соединения, ко торые способны взаимодействовать с подвешенными, функциональными группа ми молекулы фермента.. Чаще всего такими функциональными группами являются аминогруппы, обычно первичные аминогруппы, которые могут взаимодествовать с широким кругом функцио - нальных групп, таких как карбоновые кислоты, сульфонилгалиды, альдёги- , ды, изоцианаты пропиолаты и тому подобные. ..

Так, сшивающие агенты .включают ангидриды дикарбоновьгх кислот, как янтарный а:нгидрид, и адипиновый. . ангидрид, соответствующие диаль- дегиды такие, как глиоксаль, сукцинальдегид и глутаральдегид.; такие ненасыщенные соединений как акролеин и кротональдегид, такие : диолпропиолаты, как этиленгликоль- биспропиолат, пропиленгликольбиспро

пиолат, и гексаметиленгликольбйс-

пропиолат, и дисульфонилгалидыутакие, как бензол-1,3-дисульфонил- хлорид; нафталин-1,5-дисульфонил- хлорид и толил-2,4-дисульфонилхлорид. . : V

Кроме того, так как фермент содержит или может быть получен так, что содержит кислотные группы, взаимодействующие с аминами, именно 6ифункци ональные амины можно использовать в качестве сшивающих агентов для целей изобретения. Они включают, например, диамины, содержащие вплоть до 12 атомов углерода, например нилендиамин, бутилендиамин, гекси- , лендиамин, октилендиамин, пентилен- диамин, этилендиамин и додецилендиа- мин.

о

0

5

5

0

5

Количество сшивающего агента мо- i жет существенно изменяться, причем отношение фермента к сшивающему агенту находится в интервале от около 0,1 до около 0,0001. Способ осуществления нужтлого связьшания в некоторой степени определяется природой выбраннбго сшивающего агента и ферментом. Вообще, реагенты нужно растворять в подходящем инертном растворителе и реакцию следует вести при достаточно низких температурах, чтобы избежать вредных воздействий на фермент, который .может быть чувст- вительньм к высоким температурам, Обьгчно, предпочтительна реакция при комнатной температуре или. околонее, а. в качестве реакционной среды используют воду или водные растворители..

Кроме замещения полимеризуемых винильных групп на молекуле фермента . и последующей полимеризации в соответствии с описанными ранее спот собами дальнейший вариант включает конденсацию предварительно получ - ного полимера с изомер-азой путем образования внутримолекулярных кова- лентных связей для получения стаби- .лизированной молекулы. Так, например,- полипептиды, такие . как встречающиеся в природе протеины и про-. дукты их.гидролиза, можно подверг- . нуть взаимодействию, используя известные методики для создания пептидной связи с глюкоизомеразой до получения стабилизированного фермента. Полученные таким образом продутс- ты могут быть Водорастворимыми, но им можно придать свойство не растворяться в- воде, используя такие смешивающие .агенты, как глутаральдегид, и обычно полученная сшитая ферментная система еще более стабильна.

При желании исходный фермент можно преобразовать, включив нужную . функциональную группу в молекулу в целях конденсации с ранее полученной молекулой. Так, для введения карбоксильной функциональной группы фер- .мент, содержащий свободную амнно- группу, следует подвергнуть взаимодействию с дикарбоновой кислотой для превращения в ферментj содержащий карбоксильную группу.

Предварительно полученными полимерами, которые следует использовать в описанном ранее варианте, могут

10

15

20

быть любые, которые содержат нужный тип и количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп для проведения нужной реакции. Предпочтительными являются полипептиды, такие как природные протеины, например хитозан, дрожжевой протаин и тому подобные, так- же как и смеси; и полимеры, содержащие аминогруппы, такие как полиэти- ленимин. Обычно предпочтительные предварительно полученные полимеры образуют водорастворимые продукты и предпочтительно придать им нерастворимость за счет взаимодействия со сшивающими агентами, напри- мер. глутаральдегидом и другими описанными ранее соединениями.

Во всех описанных способах модификации ферментов существенным является условие, чтобы достаточное количество функциональных групп, например аминогрупп или карбоксильных групп, имелось в наличии для дости- 25 жения заметного уровня искомого результата,,

Так, например, при выборе предварительно полученного полимера, ко- . торый должен взаимодействовать с ферментом, требуется,чтобы полимер содержал группы, которь е могут реа- гировать с доступными группами молекулы фермента. Так, протеин с подвешенными карбоксильными группами следует выбирать для взаимодействия с подвешенными .аминогруппами фермента. Кроме того, должно сутцествоватв разумное количество реакционноспособ- ных групп у выбранного реагента, чтобы обеспечить множество точек присоединения реагентов для достижения существенной стабилизации.

Еще один способ, С помошью которого можно повысить термостабильность фермента, состоит в химическом изменении структуры поверхности без заметных потерь-активности. Так, по- верхностные аминогруппы можно ами- дировать или гуанидировать до получения заместителей, сильно напомина - ющих аргинин, Лактикдегидрогеназа и некоторые другие протеины были стабилизированы, Один IGIU является количеством нзомеразы, которое превращает 1 микромоль глюкозыво фруктозу в течение 1 мин в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на 1 л, 0,02 моль MgSO на 1 л и 0,001 моль ,

30

35

40

45

50

55

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

CoCl на 1 л при рК 6,85 (0,2 М ма- леат натрия) и при температуре при определении вышеуказанным способом.

Пример 1. Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы при высоких температурах до достижения композиции, содержащей 55,5% фруктозы в расчете на сухую массу, при использовании двухстадийной системы изомеризации.

Растворимую глюкозоизомеразу по- Л лучают по способу, аналогичному способу, oпиcaннo 9y в патенте США № 3788945.

Вид Streptomyces rubigencsus, полученный из S, rubigenosus АТСС 21175, выращивают подводной аэробной ферментацией на среде следующего состава, мас.%:

Декстроза9,0

Сироп замоченной

кукурузы (твердая

часть)1,6

Диаммонийфосфат 0,08

Сульфат марганца 0,06

Противовспенивающий агент (Плурс- .

ник PZ-61)0,003

Указанную среду стерилизуют при

в течение 45 мин, охлаждают и. устанавливают рН 6,8-7,0, Ее иноку- лр1руют 14 об,% икокулюмом, содержащим затравочный ферментер, полученный с помощью S, rubigenosus варианта, указанного выше„ Ферментацию проводят в.асептических условиях при 30 С в течение около 60 ч при аэрации. S, rubigenosus АТСС 21175 можно также использовать для иноку- лиров.ания и получения изомеразы, В этом случае используют среду следующего состава, мас,%:

Декстроза0,24

Сироп замоченной

кукурузы , Ствердая

часть)1,5

Сорбитол1,6

,02

Диаммонийфосфат 0,56

Ксилоза .1,0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из S, rubigenosus. Затем полученный экстракт фильтруют до получения раствора сырой неочищенной глюкозоизоме- разы.

Неочищенную глюкозоизомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе,

121° С

10

20

25

фильтрованием и промывкой адсорбированного продукта, Ogl М NaCl раствором для удаления примесей,-а затем, десорбируя путем контактирозания с 0,45 М раствором TSaClj рН всех растворов поддерживают при 7,5 во время стадий очистки Раствор частично .очищенной изомераэы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами 95% этанола при О G до осаждения изомеразы. Добавляют перлитный фильтр, твердую часть выделяют фильтрованием и сушат воздухом до получения растворимого препарата изо- ,г меразы, содержащега 2500 IGIU/r. Удельная активность препарата изомеразы составляет 40 IGIU/мг протеина, .

Низкотемпературный () реактор изомерации приготавливают, набивая иммобилизованную изомеразу, подготовленную по способу патента CD1A. №3788945, в стеклянную колонку диаметром до 2,54 см до получения слоя 5 см по высоте, содержащего 20000 IGIU .активности, В .верхнем пространстве над слоем насадки устанавливают термометр и располагают стеклянные шарики для- сведения к минимуму мертвого объема,:насколько это возможно Колонка имеет впускное и выпускное отверстие и окружена . рубашкой Для циркуляоди, воды из., .. термостата , ., , . ,

Высокотемпературный реактор (ЭЗ с) подготавлршают таким: же образом,, используя.иммобилизованную изомеразу, полученную адсорбцией очищенной изомеразы. на .ДЕАЕ-целлюлозе Слой насадки содержит 97000 IGIU и имеет высоту 15 см

Один IGIU представляет .собой количество изомеразы, которое превращает 1 мкмоль глюкозы во фруктозу за 1 мин в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на 1 л,. 0,02 ммоль MgSO. на 1 ли 0,001 моль CoCl. на 1 л при рН 6.,85 (0,2 М малеата натрия) и при температуре 60°С.

Раствор, содержащий глюгсозу, под готавливают, растворяя кристаллическую глюкозу в деминерализованной воде до получения раствора, содержа- щего 48% сухого вещества по массе. Активирующий и стабилизирующий агенты растворяют в растворе глюкозы до получения 25 мМ натрийметабисульфи- та, 5 мМ сульфата магния и 0,1 мМ

30

35

40

45

50

55

0

0

5

г

0

5

0

5

0

5

хлористого кобальта рН раствора устанавливают 6,8 гидроокисью натрия.

Первую стадию низкотемпературной изомеризации проводят при 70 С, прокачивая вышеуказанный раствор глюкозы через низкотемпературный реактор со скоростью 3,7 мл/мин. Первые 2500 мл раствора, поступающего из реактора, сливают, а поток поступающий из реактора после этого,, собирают для использования на второй высокотемпературной стадии. При высокотемпературной изомеризации раст- вор, полученный при изомеризации при 70°С, прокачивают через вы- сокотемпературньй реактор, подготовленный, как описано выше, со скоростью 5 мл/мин, поддерживая температуру в реакторе 93°Со Время контактирования раствора в высокотемпературном реакторе с иммобилизованным ферментом составляет около 12 миНо ° Полное время, в течение которого раствор находится при температуре 93 С внутри реактора, составляет около 18 мин. Полученный раствор охлаждают в ледяной бане немедленно . после того, как он поступает из высокотемпературного реактора и рН его устанавливают 4,.0. Поток, вытекающий Из высокотемпературного реактора, в течение первого часа сливают.

Изомеризованный раствор глюкозы,, полученный из реакторов, работающих при 70 и 93°С, анализируют на содержание, углев.одрв и окраску, полученные результаты сравнивают- с аналогичными результатами, полученными для неизомеризованного раствора ГЛ50КОЗЫ, как показано в табл. 1.

Полученные результаты показывают, что содержание фруктозы 55,5% можно достичь при содержании псико- зы менее 0,5 мас.%. Окраска - менее, чем 5 (CI RF х 100),

Содержание углеводов определяют по. способу Е-61, а окраску по способу F-14, стандартных аналитических методов МетЪег companies of the Corni Refine.rs Association, Corn Refiners Association, Inc., 1001 Connecticut Avenue,Washington,. D.С. 20036

Значения окраски, полученные по способу F-14, умножают на 1-00 и приводят в ви,це (CIRF к 100).

Пример 2с, Иллюстрирует получение содержащего фруктозу продукта с содержанием фруктозы 55,2%,

получейного из глюкозосодержащего раствора, состоящего, главным образом, из очищенного гидролизата кукурузного крахмала,

Гидролизат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в патенте США № 3644126 (ожижение) и патенту США № 3280006 (оса-, харивание), Осахаренный сироп очищают по способу патента США № 3834940 до получения продукта, содержащего 95,3% глюкозы в расчете на сухую массу и 50% полного содержания твердой части. Добавляют достаточное количество кристаллической глюкозы для доведения полного содержания глюкозы до 87,1% в расчета на,сухую массу. Полученный таким образом раствор имеет следующий состав :

Полное содержание сухого вещества, % 42,4 Глюкоза, % в расчете на сухую массу97,1

Фруктоза, % в расчете на сухую массу0,1

Полисахарид, % в расчете на сухую массу 258 Псикоза, % в расчете ка сухую массу0,0

NaHSOj, мМ , - 50,0. MgSO, мМ 5,0. ,СоС1, , I .. 0,1

РН - 6,8

Высокотемпературный реактор подготавливают, как описано в примере 1, он содержит 147500 IGIU в слое 16,5 см высоты. Температуру поддерживают 97,4°С. Вышеуказанный раствор прокачивают через слой насадки со скоростью 4,4 мл/мнн. Первые 50 мл потока, вытекающего из реактора, сливают, а поступающий из реактора после этого поток отбирают на анализ. Полученные результаты представлены ниже в сравнении с составом неизомеризованного раствора глюкозы (табл. 2)..

Полученные результаты показывают, что можно получить уровень фруктозы болев 55% при образовании лишь 0,2% псикозы. Более сильное окрашивание продукта в этом примере связано с тем, что всю изомеризацию проводят при высокой температуре (97,) в противоположность двухстадийному способу примера 1, где большая часть фруктозы была образована при более низкой темпера- туре (т.е. при 70°С и окрашивания удалось избежать, благодаря исполь- зованию двухстадийного реактора. Тем не менее, окрашивание составило величину менее 13 (CIRF «100).

П р и м е,р 3, Демонстрирует получение продукта с содержанием фрук- Q тозы 55,3% в расчете на сухую массу из глюкозосодержащего раствора, состоящего из очищенного гидролизата кукурузного крахмала плюс кристаллическая глюкоза, при использовании 5 двухстадийной систеьа изомеризации, причем на второй стадии используют коммерчески доступную иммобилизованную глюкозоизомеразу.

Растворнмз ю глюкозоизомеразу g для реактора первой стадии получают и очищают по способу, описанному в примере 1. Удельная активность зто- го препарата составляет 40,9 IGIU/мг . протеина. Всего 25000 IGIU этого 5 фермента иммобилизуют, адсорбируя на 10 г Ватман ДЕ-23 ДЕА-Е-целлюлозе Этот иммобилизованный фермент используют для приготовления реактора на 70 ( в стеклянной колонке диаметром 0 2,54 см с рубашкой, как описано в примере 1, Высота слоя насадки составляет 13 см.

Субстрат для этого реактора подготавливают точно так же., как и в примере 2, и он имеет следующий состав:

Полное содержание сухого веашства, % 50,2 Глюкоза, % в расчете на сухую массу 97,6 Фруктоза, % в расчете на сухую массу Полисахарид, % в расчете на сухую массу 2,4 Псикоза0,0

KaliSO, , мМ50,0

MgSO, мМ5,0

CoCli0,1

рН6,8

Низкотемпературную изомеризацию проводят при 70°С, прокачивая вьш1е- тсазанньй раствор субстрата через низкотемпературный реактор со скоростью потока 3,2 мл/мин. Первые 1000 мл поступающих из реактора сливают. Поток se, поступающий после этого,собирают для использования на второй ста-, дин высокотемпературной изомеризации.

5

0

0,0

5

0

5

Фермент5- который используют для получения высокотемпературного .реактора, является коммерчески доступной иммобилизованной изомеразой.

Этот фермент, Maxaz yme GI, иммобилизованный, партия К-12467, вначале измельчают в ступке для уменьшения размера частиц. Затем измельченный фермент пропускают сквозь стандартное сито 20 мешей, а ту часть5, которая, удерживается ситом 60 мешей, суспендируют в субстратv и деаэрируют в условиях лабораторно го вакуума при 60°С в течение 60 ми Затем деаэрированную суспензию используют для приготовления слоя насадки 1,5к39 см в стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержи 5200 IGIU.

Субстрат, полученньй на первой стадии 70 С изомеризации, доводят до рН 6,5 и разбавляют до содержания сухой части 42,6%. Затем полученный субстрат прокачивают через колонку со скоростью потока 5 мл/ми при 60°С в течение 30 мин. Температуру внут.ри колонки контролируют термометром, расположенным непосредственно над слоем насадки и окруженным стеклянными шариками 0,5 MM диаметром для сведения к минимуму мертвого объема, насколько это возможно. Затем температуру колонки быстро повьшают за счет циркуляции воды из термостатированной при 97,8°С бани через рубашку. Когда температура колонки достигает 97°С5 скорость потока субстрата снижают до 2,0 мл/мин. При этой скорости потока время контак-тирования субстрата с иммобилизованным ферментом составляет около 22 мин, а полное время пребывания раствора внутри реактора при составляет около 35 мин,

Поток, вытекакяций из колонки, контролируют записывающим поляриметром, откалибреванным на значения уровня фруктозы от 50 до 58%. Когда содержание фруктозы в вытекающем из колонки потоке достигает нужного уровня, зтот вытекающий поток собирают и охлаждают немедленно в ледяной бане о рН устанавливают 4,0, добавляя 1 М лимонную кислоту. Вытекающий поток собирают до тех пор, пока содержание фруктозы не падает ниже 55%.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов при 70 и §7., анализируют на содержание углеводов-и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными для раствора неизомери- зованного субстрата, как показано в табл. 3.

Полученные результаты показывают, что уровень фруктозы 55,3% можно достичь, сохраняя содержание пси- козы менее 0,4 мас.% в расчете на сухую массу.

Пример 4. Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы при высокой температуре до получения композиции, содержащей 55,8% фруктозы, при условии, что вторую стадию изомеризации проводят на иммобилизованной изомера- зе, полученной из вида .Arthrpbacter.

Штамм Arthrobacter citraus выращивают в условиях подводной аэробуой ферментации на среде следующего сос- тава, мас.%:

Ксилоза1,5

BHI (мозговая питательная среда). 4,2 Дрожжевой экстракт 0,1 Хлористьй натрий 0,2 Казеиновая аминокислота0,5 Сульфат магния0.024 рН 6,9-7,2 Ферментацию проводят в асептичес- ких условиях при 30 С в течение

44 ч. Клеточную массу собирают центрифугированием промывают 0,85%-нь1м хлористым натрием и снова центрифугируют. При этом получают 76 г кле-

точной массы при полной активности изомеразы 10260 IGIU.

Глюкозоизомеразу экстрагируют из 45 г клеточной массы, суспендируя клетки в 25 мл воды, содержащей 900 мг лизоцима куриного яйца и 250 мг сухих шариков поверхностно- активного ВТС-835 (Оникс Кемикал Ко), устанавливая рН 7,0, инкубируют. 16 ч при 45°С„ Затем полученную суспензию центрифугируют и собирают надосадочную жидкость. Нераство- римьй .материал повторно суспендируют в 250 мл 0,1% Тритон Х-100

(Сигма Кемикал Ко), рН 7,0 и инкубируют в течение 8 ч при 45°С. Эту суспензию центрифугируют, и надосадочную жидкость объединяют с жидко25

стью, полученной при первом центрифугировании.

Объединенные экстракты концентрируют и очищают ультрафильтрацией с Амикон 401 ячейкой с перемешиванием, используя мембрану УМ-30. Остаток дважды фильтруют с двумя 5-кратными объемами 0,2 мм CoCl, 1 мМ MgSO раствором при рН 7,0. Конечньй остаток после ультрафильтрации содержит всего 3115 IGIU. Этот фермент используют для получения иммобилизованной чзомеразы путем адсорбции на ДЕАЕ-целлюлозе по способу патента США 3788945. К раствору добавляют всего 4,0 г Ватман ДЕ-23, рН устанавливают 7,0 и полученную суспензию перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре.

Полученный нерастворимый фермент собирают фильтрованием, про- мывают водой. Часть промытого иммобилизованного фермента суспендиру- ют в субстрате, деаэрируют при 60° в течение 60 мин и используют для приготовления слоя насадки 1,5 х13 см в высокотемпературном реакторе.

Субстрат для реактора приготавливают по способу примера 1 на первой стадии () изомеризации. Этот субстрат имеет следующий состав;

Полное содержание

сухого вещества, % 42,6

Глюкоза, % в расчете

на сухую массу46,9

Фруктоза, % в расчете

на сухую массу52,3

Полисахарид, % в расчете

на сухую массу0,8

Псикоза0,0

NaHSO,, мМ50,0

MgS04, мМ5,0

CcCl, J-iM0,1

рН6,7

Этот субстрат прокачивают через реактор, при 60°С в течение 30 мин со. скоростью потока 6 мл/мин. Зате температуру колонки быстро повышают до 97,8 С, скорость потока снижают до 2 мл/мин и вытекающий поток контролируют, как в предьздущем примере. Вытекающий поток собирают в ледяную баню и устанавливают рН 4,0 1 М лимонной кислотой.

10

15

20

25

2305626

Поток, вытекающий из реактора 97,, субстрат, полученный на первой стадии (70 с) изомеризации и исходный раствор-декстрозы, который используют в качестве субстрата для реактора, работающего при 70°С, анализируют на содержание углево- дов и окраску.

Полученные результаты приведены в табл. 4.

Полученные результаты показывают, что можно получить 55,8% фрукто- зь при сохранении уровня псикозы ниже 0,2%, а окраску ниже 6 (CIRFKlOO),

Пример 5. Демонстрирует применение двухстадийной системы изомеризации, в которой реактор второй стадии используют при температуре выше ЮО С для получения продукта с содержанием фруктозы 55,5%.

Субстрат для реактора второй стадии получают в реакторе первой стадии точно так, как описано в примере 3, и рН устанавливают 6,6 Иммобилизованная изомераза для реактора второй стадии представляет собой изомеразу Maxazyme-. GI (иммобилизованная), которую измельча- 3Q ют и просеивают, как описано в примере 3. Полученный фермент суспендируют в субстрате, деаэрируют при 60°( и используют для получения 1,5x40,5 см слоя насадки в высокотемпературном реакторе. Полная активность изомеразы составляет 5820.IGIU. Субстрат прокачивают через .реактор при скорости потока 6 мл/мин всего в течение 60 мин. Затем температуру колонки повышают до 102 С, скорость потока субстрата снижают .до 3 мл/мин.

Б этих условиях время контактирования субстрата со слоем фермента составляет около 16 мин, а полное время пр ебывания при 102°С составляет около 24 мин.

Поток, вытекающий из колонки, собирают и анализируют, как описано в примерах 3 и 4. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Получают продукт, который при сое- держании фруктозы 55,5%, содержит только 0,2% псикозы.

Пример 6. Демонстрирует непосредственную изомерацию глюкозо- содержащего раствора, состоящего преимущественно из очищенного гидро- лизата кукурузного крахмала, с полу35

40

50

55

чением композиции с содержанием 55,5 масД фруктозы в расчете на сухую массу, если используют двух- стадийный процесс изомеризации. Вначале проводят изомеризацию при низкой температуре (70°С) и продукт этой реакции используют в качестве сырья во втором высокотемпературном реакторе (ЮЗ.) содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабилизированная изомера- за является изомераЗОЙ, в которой фермент ковалентно связан с раство- римьм полимером, а затем превращен в нерастворимый для получения иммобилизованного катализатора.

Гидролизат получают из кукурузного крахмала по способу, описанному в патенте ОМ № 3644126 (ожижение) и № 328000 (осаживание). Осахарен- ный сироп очищают по способу патента США № 3834940 до получения продукта содержащего 95,3% глюкозы . в расчете па сухую массу. Добавляют достаточное количество кристал- лической глюкозы для доведения полного содержания глюкозы до 97,6% в расчете на еухую массу. Полученный раствор- имее т следующий состав: Вещества сукого всего, % .50,2 Глюкоза, % в расчете на сухую массу 97,6 Фруктоза,, % в расчете на сухую массу0,0 Полисахариды., % в. расчете на сукую массу 2,4 Лейкоза, % в расчете на сухую массу 0,0 NaHSOj, 1 50,0 MgS04., мМ : 5,0 ,

CoClj, 1

0,1

рН6,8

Низкотемпературную изомеризацию проводят при 70 С, прокачивая раствор вьшеуказанного субстрата через низкотемпературньй реактор со скоро- стью потока 3,2 мл/Мин. Низкотемпературный реактор () изомеразы вьшолнен путем уплотнения изоме- разы, иммобилизованной на ДЕАЕ- целлюлозе в стеклянную колонку диаметром 2,54 см, снабженную входным и выходным отверстиями с рубашкой для циркуляции в оды., из термостата. В верхней части под насадкой имеется термометр, а остальное пространство заполняется стеклянными

шариками для снижения мертвого пространства насколько это возможно. Реактор содержит достаточное количест- во изомеразы для обеспечения

20000 IGIU и слой насадки имеет высоту около 15 см. Первые 1000 мл, поступающие из реактора, сливают. Вытекающую после этого жидкость собирают для использования на второй стадии высокотемпературной изомеризации.

Химически стабилизированный катализатор, который .используют в высо- 5 котемпературном реакторе, получают следующим образом.

Вид Streptomyces rubigenosus, по- лученньн из S. rubigenosus АТСС 21175, выращивают подводной аэробной фермен- Q тацией на среде следующего состава, мас.%:

Декстроза9,0

Сироп замоченной кукурузы (твердая часть) - 1,6 5 Диаммонийфосфат0,08

Сульфат марганца 0,06 Антивспенивающий агент (Плуроник PL-61) 0,003

0 Указанную среду стерилизуют при 121°С в течение 45 мин, охлаждают и устанавливают рН 6,8-7,0. Среду ино- кулируют 14% (.мае./мае.) инокулюма, содержащего затравочный фермент, полученной из S. rubigenosus. Ферментацию в.едут в асептических условиях при 30°С в течение около 60 ч при аэрации 0,65 ллгт (процентное соотно- . шение объемов в минуту). Для иноку- Q лирования и получения изомеразы можно также использовать S. rubigenosus. АТСС 21175, но в этом случае исполь-. зуют среду следующего состава, мас.%: Декстроза0,24

Сироп .замоченной кукурузы (твердая часть) },5 Сорбитол1,6

Хлорид кобальта. 0,02 Диаммонийфосфат 0,56 Ксилоза1 0

Глюкозоизомеразу экстрагируют из S. rubigenosus, добавляя 0,35% Maguat МС1412 (Мейсон Кемикал Ко.) и 10 ч. на млн лизоцима куриного яйца, и перемешивая в течение 5 ч при 40 С, рН 6,3-6,6, Затем полученную смесь фильтруют до получения раствора сырой неочищенной глюкозо- изомеразы.

5

29

Неочищенную изомеразу очищают адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе с пес™ ледутщей фильтрацией и промывкой адсорбированного продукта 0,1 М раствором NaCl для удаления примесей, а затем десорбируют изомеразу, подвергая ее контактированию с 0,45 М раствором NaCl. рН всех растворов поддерживают 7,5 на всех стадиях очистки. Раствор частично очищенной изомеразы, полученный при этом, смешивают с 3 объемами 95%-ного этанола при О С для осаждения изомеразы.

Твердую часть вьще.ляют фильтрование и сушат воздухом до получения растворимого препарата изомеразы, содер жащего 2500 IGIU/r.

Очищенную изомеразу растворяют в 1 мМ MnGl до получения раствора, содержащего 10 мг изомеразы на 1 мл при комнатной температуре и полученную смесь фильтруют для удаления фильтра.

Удельная активность этого препарата составляет 37,3 lGIU/мг протеина. .

Раствор растворимого полиаминно- го полимера получают, -растворяя 39,0 г хитозана в 13 л 0,08 н. НС1. После растворения раствор хитозана доводят до 0,5 М в KaCl, добавляя 380 г NaCi, и рН полученного раствора устанавливают 6,15 8 н. NaOH. . Хит03ановый раствор фильтруют.че-. рез, фильт.р бумаги Батман 3 для удаления нерастворимого материала. К 13 л 0,3%. хитозана в 0,5 К NaCl при рН 6,1;5 добавляют 200 мл растворимой изомеразь, содержащей 100000 IGIU активности, 197,6 г . ксилитола и 0,619 г CoClg -611,0. Полученный раствор перемешивают в тчение 2 ч, после чего 6,24 г 1-этил 3-диаметиламинопропилкарбодиимида добавляют для ковалёнтного связывания во множестве точек карбоксильных групп изомеразы с аминогруппами хитозана. Спустя 2 ч при комнатной температуре 15,6 мл 50%-ного тлута- ральдегидного раствора устанавливают. рН 6,0 с помощью З н. NaOH и добавляют в реакцию для придания нерастворимости ковалентносвязанном комплексу изомераза-хитозан. Спустя 15 мин 2 л 1 М фосфатного раствора при рН 8,0 добавляют для облегчения разделения геля после того, как он образовался, при добавлении глутар

2305630

альдегида. Полученный нерастворимый изомераза-хитозан промьшают деиони- зированной водой на вакуумном фильтре Бюхнера. Полученньш препарат далее сушат на воздухе в течение ночи при комнатной температуре, затем .измельчают и просеивают сквозь сито 12-60 мешей. Сухой катализатор облаJQ дает выраженной активностью 384 IGIU/r,

Порцию катализатора (13 г) суспендируют в субстрате и деаэрир тот в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин.

1Ц Суспензию, в которой удален воздух, используют для подготовки слоя 1,5 IS 20 см насадки в стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит .4992 IGIU,

Субстратj полученный иа первой стадии при 70 С изомеризации, доводят до рН -6,5, и разбавляют до содержания сухого вещества 42,0%. Затем этот субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного ре20

25

актора под давлением при скорости потока 1,96 мл/мин при в тече

ние 30 мин Температуру в колонке контролируют тepмoмeтpo, располо- женньм- непосредственно над слоем и окруженным 0,5 см сТ-еклянными шариками для минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Затем темпе- .ратуру колонки быстро повышают за счёт циркулирующего через рубашку масла из термостатированной при Юб С бани.

Вытекающий из колонки поток контролируют на поляриметре, откалибро- ва-нном на значении от 50 до 58% фруктозы. После того, как температура в колонке достигает 105,2°С, и когда содержание фрук тозы в вытекающем потоке достигнет нужного уровня, вытекающий поток отбирают и немедленно охлаждают в ледяной бане. рН устанавливают 4,9, добавляя М .лимонную кислоту. Вытекающий поток собирают до тех пор, пока относительный уровень фруктозы не падает ниже 55%.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов 70 и 05,2°С, -анализируют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналопиными данными для неизомеризованного раствора субстрата (табл. 6),

Полученные результаты показывают, что 55,5% фруктозы достигают

31

при содержании псикозы менее

0,5 мас,% в расчете на сухую массу,

а окраска менее 20 (CIRFxlOQ).

П р и и е р 7. Демонстрирует прямую изомеризацию раствора, содер- жашего глюкозу (состоящего из очищенного гидролизата кукурузного крахмала плюс кристаллическая глюкоза), при высоких температурах для достижения состава, содержащего 55,2% фруктозы в расчете на сухую массу, в случае, когда используют двухста- дифную изомеризацию, причем на второй стадии используют химически стабилизированную изомеразу, состоящую из -глюкозоизомеразы, закомплексованной с полиэтиленимином, причем этот комплекс превращен в нерастворимый за счет обработки глутаральдегидом.

Получение стабилизированной изо- меразы.

Растворимая глюкозоизомераза была получена, как описано в примере Г. Очищенную изомеразу растворяют в . 1 мМ MnClg до. получения раствора, содержащего 9 мг изомеразы на 1 мл, при комнатной температуре и полученную смесь отфильтровывают для удалеиия фильтра, 60 мл 10% мае./объем (PEI-6). полизтиленимИн MB 600, рН 8, и-3 г ксилитола добавляют к 300 мл раствора фермента, полученный раствор перемешивают в течение 15 мин, 10 мл 2,5 М глутаральдегида добавляют., и полученную смесь пе-ре- мешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворимый фермент вьщеляют фильтрованием, промывают водой и сушат в течение ночи при 37°С, 1258 г иммобилизованной изомеразы, содержащей около 775 IGIU/r, вьщеляют после сушки, 12 г иммобилизованного фермента суспендируют в субстрате, деаэрированном в вакууме в течение 60 мин при комнатной температуре и используют в высокотемпературном реакторе с диаметром 1,5 см,

Субстрат для этого реактора получают на первой из двух стадий изомеризации, как описано в примере 1. Состав субстрата следующий;

Полное содержание

сухого вещества, % 42,6

Глюкоза, % в расчете

на сухую массу46,4

Фруктоза, % в расчете

на сухую массу51 ,.3

-

32

Полисахарид, % в расчете на сухую массу 2,3 Псикоза, % в расчете на сухую массу0,0 NaHSOj, мМО , мМ .50 CoCl,, мМ0,1 рН6,75

10

15

20

30

Субстрат прокачивают через реактор при 60 С в течение 45 мин со скоростью около 5 мл/мин. Затем температуру колонки повыщают до 101,6°С, а скорость потока снижают до

2мл/мин. Вытекающую жидкость контролируют записьшающим поляриметром, откалиброванным на значения от 50 до 58% фруктозы. Вытекающий поток,

3котором содержание фруктозы пре- выщавт 55%,собирают в ледяную баню и устанавливают рН 4,0 с помощью 1,0 М лимонной кислоты,

, Поток, поступающий из высокотем- пературного реактора, субстрат из 25 реактора первой стадии и исходный содержащий глюкозу раствор, который используют в качестве субстрата для первой стадии реактора, проанализировали на содержание углеводов в композиции и на окраску. Полученные результаты приведены в табл, 7,

Полученные результаты.показывают, что достигают уровня, фруктозы 55,2%, поддерживая уровень псикозы ниже 0,2 мас.% в расчете на сухую массу.

Пример 8, Демонстрирует прямую изомеризацию глюкозы до 57,2% фруктозы путем двухстадийной изомеризации, в которой первый реактор работает при 70°С, а второй (высокотемпературный) реактор функционирует при IIО,4°С. Химически стабилизированная изомераза, которздо используют в высокотемпературной реакции, является изомеразой, в которой фермент ковалентно связан с растворимым полимером, а затем полимер превращен в нерастворимый для получения иммобилизованного катализатора.

Субстрат и его конверсия в реакторе первой стадии при 70 С бьти описаны в примере 1,

№.мобилизованный катализатор, ко- торьй используют в высокотемпературном реакторе при 110,4 С, также бып описан в примере 1,

Реактор на 110,4 С подготавливают следующим образом. Порцию ката35

40

45

50

55

33

лизатора 28,4 г суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин. Деаэрированную суспензию используют для получения слоя насадки 2,5 Д12,4 см в стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит 10,885 IGIU.

Субстрат, полученный на первой стадии (70°С) изомеризации, доводят до рН 6,47 и разбавляют до 42,0% сухого вещества. Затем полученный субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением и при скорости потока 3,38 мл/мин при температуре 60°С в течение 30 мин. Температуру -в колонке контролируют с пом.ощью термометра, расположенного непосредст- венно над слоем и окруженного 0,3 с стеклянными шариками для минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Затем температуру колонки быстро повьшают за счет циркуляции через рубашку масла из термостатиру емой при бани.

Поток, вытекак.гаий из колонки, контролируют с помощью записьшающе- го поляриметра, откалиброванного на значения уровня фруктозы от 50 до 58%. После того, как температура, ко лонки достигает ПО,4°С и когда содержание фруктозы в вытекающем потоке достигает нужного уровня, вытекающий продукт собирают и немедленно охлаждают на ледяной бане. Значение рН устанавливают 4,0, до- бавляя 1 М лимонную кислоту.

йзоме-ризованные растворы, полу- ченные из реакторов 70 и ПО,, анализируют на содержание углеводов и окраску, полученные результаты сравнивает с результатами анализов, проведенных для раствора неизомёри- зованного субстрата (табл. 8). . Полученные результаты показывают, что 57,2% фруктозы достигают пр содержании псйкозы ниже 0,4 мас,% в расчете на сухую .массу, а окраска (CIRFxIOO). ниже 20. Пример 9. Демонстрирует пр мук, из.омеризацию содержащего глюкозу раствора, содержащего очищенный гвдролизат кукурузного крахмала для получения композиции 56,3% фруктозы в расчете на сухзпо массу, если используют двухстадийный процесс изо2305634

меризации. Вначале проводят низкотемпературную изомеризацию при 70 С, продукт, полученньй на этой стадии, используют в качестве сырья на второй высокотемпературной стадии в реакторе с температурой 103,3 С, .содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабили Q зированная изомерава представляет собой изомеразу, в которой фермент подвергнут совместной реакции с за- щитньш протеином (таким, какой получают из дрожжей).

15 Низкотемпературная стадия изомеризации,, включая описание субстрата и экспериментальные условия, представлена в пршчере 1.

Химически стабилизированный фероп мент глюкозоизомераза, использо.ван- ный в высокотемпературном реакторе, получают следующим образом. Растворимую глюкозоизомеразу для химической стабилизации получают и очйша25 ют по способу, описанном в приме- ре 1. Удельная активность этого препарата составляет около 40 IGIU/мг протеина. Защитный протеин -получают из пекарскюс дроз(жей следующим обра0

5

зоМо к 1229 г элажных пекарских дрожт жей добавляют 1000 г воды и 500 г толуола. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение около 30 мин. Полученную смесь фильтруют на воронке Бгохнера. Почти

весь толуол остается с нераствори- мьми осколками клеток, тогда как водный экстракт содержит растворимый экстракт дрожжей. Водный фильтрат упариваюх до объема 276 г (роторный испаритель, 40°С), затем при перемешивании добавляют 4 г трифторуксус- ной кислоты. Осажденный дрожжевой протеин собирают, затем повторно растворяют в О,I М натрийфосфатном

буфере (рН 7,0). После осветления фильтрованием полученный раствор обрабатывают 900 мл (около -3 объемов) ацетона. Осадок собирают, растворяют в 0,0} М натрийфосфатном буфере (рН 7,0), а оставшийся раствор диализуют против 0,01 М натрийфос- фатного буфера. Полученньтй продукт (150 мл) считают защитным протеином, полученным из пекарских дрожжей.

° 0,6%-ный раствор хитозана получают, растворяя 24 г хитозана в 4 л 0,08 н. НС1. рН раствора устанавливают 6,2 8 н. NaOH, фильтруют че35

рез фильтровапьн5то бумагу Ba-Ji MaH 3, проводят диализ против & л деионизированной водыс В химический стакан объемом 400 мл помещают около 100000 IGIU растворимой глюкозоизо- меразы-фермента (в смеси с фильтром), 1 г ксилитола и 100 мл (2/3) защищенного протеина, полученного из пекарских дрожжей. К этой смеси добавляют 2., 4 мг MgS04 и 24 мкл молярного раствора хлористого кобальта. Полученную смесь фильт.руют для удаления фильтра, а затем раствор концентрируют (роторный испаритель, ) почти досуха в двухлитровой круглодонной колбе. Затем в эту колбу- добавляют 800 мл хитозана (рН 6,2). Полученн ую смесь, концентрируют почти досуха и добавляют 640 мкл 50%-ного раствора глутар- альдегида(рН устанавливают 6,5). Полученную смесь хранят в холодной йомнате в течение ночи. Затем гель удаляют из колбы и продавливают сквозь сито 30 мешей,. сушат в су- шильн ом шкафу примерно при 37°С, Высушенный прецарат фермента npoce- ивают для удаления мелких частиц, а затем используют (8,9 т конеч-ного продукта) для изомеризации в высоко- . температурном реакторе.

. Реактор для работы при 103,3 С подготавливают следующим образом. Полученную ранее глгбкозоизомеразу (8j9 г) суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакутма при комнатной темпера- .. туре в течение около 30 мин. Деаэрированную суспензию используют для риготовления слоя насадки 1,5 х и29 см в стеклянной колонке с рубашкой. Субстрат, полученньй на первой стадии изомерации при , доводят до рН 6,75 и разбавляют до содержа- ния 42,6% сухого Вещества, Затем полученный субстрат прокачивают через высокотемпературную колонку со скоростью потока около 1,5 мл/мин-при температуре 600°G в течение 30 мин. Температуру внутри колонки констро- лируют термометром, расположенным непосредственно над слоем и окруенным стеклянными шариками (0,5 см диаметром) для минимизации мертвого объема. Температуру колонки резко повьш1ают за счет циркуляции через рубашку колонки масла из термоста- тирова-нной при 104 С рубашки.

15

, .

23056 ,36

Поток, вытекающий из колонки, контролируют с помощью записьюающего поляриметра, откалиброванного на . значения от 50 до 58% фруктозы.

Собирают фракции по 5 мл до тех пор, пока не полз чают значения содержания фруктозы 55% или выше, после чего эксперимент заканчивают. Вовремя 1Q. отбора образцов полученный на выходе продукт немедленно охлаждают в ледяной бане, и рН устанавливают примерно 4,0, добавляя 1 М раствор лимонной кислоты (о, мл), затем разбав- 15 ленную НС1.

Изомеризованные растворы, полученные из реакторов 70 и 103,3°С, анализируют на содержание углеводов и окраскуо Полученные результаты 2Q сравнивают с аналогичными данными для неизомеризованного раствора субстрата (табл. 9).

Полученные результаты показыва5

0

5

0

5

0

5

ют, что достигают уровня 56,3% фруктозы при содержании псикозы менее 0,2 мас.% в расчете на сухую массу.

Пример 10. Демонстрирует непосредственную изомеризацию рйст- вора, содержащего глюкозу, которьй состоит .из очищенного гидролизата кукурузного крахмала с небольшой концентрацией соли, для достижения композиции 55,4% фруктозы в расчете на сухую массу при использовании . процесса двухстадийной изомеризации. Вначале проводят низкотемпературную изомеризацию при 70°С, полученный продукт используют в качестве сырья во втором высокотемпературном (112,6°С) реакторе, содержащем химически стабилизированную изомеразу. Химически стабилизированная изоме- раза представляет собой изомеразу, в которой фермент ковалентно связан с растворимым полимером во множестве точек, а затем продукт превращён в нерастворимый для получения иммо- билизо.ванного катализатора.

Гидролизат получают из кукурузно-. го крахмала по способу, описанному в патенте-США IJ 3644126 (ожижение) и патенте США N« 3280006 (осахаривание). Сироп очищают по способу патента CDIA Р 3834940 для получения продукта, содержапшго 93,8% глюкозы в расчете на сухую массу. Добавляют достаточное количество кристаллической глюкозы для доведения полного содержания глюкозы 96J9% в расчете на

ухую массу. Полученный раствор имеет

ледующий состав:

Всего сухого вещает- i ва, %50j3

Глюкоза, % в расчете . на сухую массу 96,9 Фруктоза, % в расчете на сухую массу0,1.

Полисахариды, % в расчете на сухую массу 3,1 Псикоза, % в расчете на сухую массу..,

NaHSOj, мМ MgSO, мМ CoCl;,, мМ

рн

2

0,0 2,5 2,5 ОИ 6,0

Низкотемпературную изомеризацию i проводят при 70 С, прокачивая вышеуказанный раствор субстрата через низкотемпературный реактор, который описан в примере 1, со скоростью 2,5 мл/мин. Первые 1000 мл, поступающие из реактора, сливают. После этого поступающий из реактора про- . дукт используют на второй стадии высокотемпературной стадии изомеризации.

Хим.ически стабилизированный катализатор, используемый в высокотемпературном реакторе, приготавливают следующим образом. Растворимую глю- козоизомеразу подготавливают и очищают по способу примера 1. Удельная активность этого препарата составляет около 40 1СГи/мг протеина. Раствор растворимого полимера, полиамин получают, растворяя 48,4 г хитозана в 15 л 0,08 н. НС1. После растворения хитозановый раствор доводят до 0,5 М в NaCl, добавляя 438 г NaCl, и рН полученного раствора устанавливают 6,1 с помощью 3 Но NaOH. Затем хитозановьй раствор фильтруют через бумажный фильтр Ватман 3 для удаления нерастворимого материала.

К 15 л 0,3% хитозана в 0,5 М NaCl при рН 6,1 добавляют 520 мл растворимой изомеразы, содержащей около 602000 IGIU активности, 236 г кси- литола и 3,07 г . Этот раствор перемешивают в течение 2 ч, после чего 7,44 г 1-этил-З-д-иметил- аминопропилкарбодиимида добавляют для ковалентного связывания во множестве точек карбоксильных групп изомеразы с аминогрупами хитозана. Через 2 ч при комнатной температуре в реакционную среду добавляют 15,5 м

50% (мае./мае.) раствора глутар- альдегида с установленным значением рН 6,0 .с помощью 8 н. NaOH, для реакции, в результате которой кова- лентный изомераза-хитозан комплекс становится нерастворимым. Спустя 15 мин 4 л 1 М фосфатного раствора при рН 8,0 .смещивают с нерастворимым продуктом изомераза-хитозан. . . Иммобилизованную изомеразу-хитозан промьгоают деионизированной водой на бюхнеровском вакуумном фильтре с фильтровальнон бумагой Батман 3.

5 Полученный продукт сушат на воздухе, измельчают и просеивают сквозь сито в интервале 12-60 мешей. Сухой катализатор обладает выраженной активностью 803,IGIU/r.

Q Реактор на 112,6 С подготавливают следующим образом. Порщло катализатора (7,0 г) суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной

5 температуре в течение 60 мин. Деаэрированную взвесь используют для получения слоя насадки 1, см в стеклянной колонке с рубашкой. Слой васадкк содержит 5621 IGIU.

рН сз бстрата, полученного на первой стадии изомеризации при 70 С, устанавливают 6,55 и субстрат разбавляют деионизированной водой до содержания 42,0% сухого вещества, что также снижает концентрацию соли до 2,1 мМ для NaHSOj и 2,1 мМ для MgSO.

Затем полученный субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением в течение 10 мин со скоростью потока 8 МЛ/НИН при 60°С. Температуру в колонке контролируют с помощью термометра, расположенного непосредственно над слоем и окруженного песком вплоть до температурной шкалы для минимизации мертвого объема, насколько это возможно. Температуру колонки резко повышают за счет циркуляции масла из термостатированной при 112,6°С бани, скорость потока снижают до 1,-89 мл/мин.

Вытекающий из колонки поток контролируют с помощью записывающего поляриметра, откалиброяанного на значения от 50 до 58% фруктозы. После того, как температура в колонке достигает 112,6 С, а содержание фруктозы в вытекающем потоке достигает

0

5

0

5

0

5

3915

нужного уровня, вытекающий поток собирают. рН немедленно устанавливают 4,0, добавляя 1 М лимонную кислоту. Вытекающий поток Собирают до тех пор, пока уровень фруктозы не падает ниже 55%

Изомеризованные растворы, полученные при 70 и 112,, анализируют на содержанке углеводов и окраску, полученные, результаты сравнивают, с аналогичными результатами, полученными для раствора неизомеризо- ванного йубстрата (табл. 10).

Полученные результаты, показьюа- ют, что 55,4% фруктозы можно достичь при сохранении уровня псикозы ниже 0,2 мас.% в ра;счете на сухую массу при окраске менее 9. (CIEFrlOO).

Пример И, Демонстрирует непосредственную изомеризацию глю- козосодержащего раствора, состоящего главным образом, из очищенного гидро лизата кукурузного крахмала с низким содержанием солей для достижения композиции с 34,8% фруктозы в расчете на сухую массу при чрезвычайно ,/ низком содержании псикозы (менее 0,1%) и окраске менее 2(CIRF)t 100),; при использовании двухс тадийного процесса. Первый.(низкотемператур- ньй) реактор функционирует при 70 С, а второй (высокотемпературньй) реактор - при 105, Химически стабилизированная изомераза, которую используют в высокотемпературном реакторе, представляет собой изо- меразу, в которой ферме.нт ковалентно связан с растворимым полимером во множестве тоЧек, а затем этот продукт превращен в нерастворимый для получения иммобилизованного катализатора. .

Субстрат и его превращение в реакторе на первой стадии при 70 С описаны в примере 5.

Иммобилизованный катализатор, который используют в высокотемпературном реакторе при 105,, такой, как описан в примере 5.

Реактор на 105,8°С подготавливают следующим образом. Порцию катализатора 5,63 г суспендируют в субстрате и деаэрируют в условиях лабораторного вакуума при комнатной температуре в течение 60 мин. Деаэрированную взвесь используют для получения 1,01(32 см слоя насадки в

0

5

056

0

5

0

5

0

5

40

стеклянной колонке с рубашкой. Слой насадки содержит 452 IGIU. и .

Субстрат, полученный на первой стадии при изомеризации, доводят до рН-6,5 и разбавляют деиони- зированной водой до достижения 42,0% сухого вещества, что, в свою очередь, снижает концентрацию сода до 2у.мМ для MgSOj и 2,1 мМ для ; HaHSO. Затем такой субстрат прокачивают через колонку высокотемпературного реактора под давлением со скоростью потока 8 мл/мин, в течение 10 мин при 60°С. Температуру внут- . ри колонки контролируют термометром,; расположенным непосредственно над слоем насадки и окруженным песком до начала тег-шературной шкалы для минимизации, насколько это возможно, мертвого объема. Затем температуру колонки резко повьппают за счет циркуляции через рубашку масла из термостатированной при около 107 с бани,

Поток, вытекающий из колонки, кбнтролируют с помощью записывающего/ поляригчетра, откалиброванного в интервале значений от 50 до 58% фрук-/ тозы. После того, как температура колонки достигает 105,8 с и когда содержание фруктозы в выходящем потоке достигает нужного уровня, этот вытекающий поток собирают. Его рН немедленно устанавливают 4,9, добавляя 1 М лимонную кислоту.

Изомеризованньй раствор из реакторов функционирующих при 70 и 105,, анализируют на состав углеводородов и окраску, полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами, полученными для раствора неизомеризованного субстрата (табл. 1Л)..

Полученнь е результаты показьша- ют, что можно достичь содержания фруктозы 5458%, сохраняя уровень псикбзы менее 0,1% в расчете на сухую массу, а окраску менее 2 (CIRFJflOO).

Формула изобретения

К Способ изомеризации глюкозы во фруктозу, включающий контактирование исходного раствора с содержанием 40 - 50 мас.% глюкозы с., термически стабильной глюкозоизоме- разой при рН 6,0-7,0 и последующее охлаждение изомеризованного раство41

pa, отличающийся тем, что, с целью уменьшения образования псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышения содержания фруктозы в растворе, контактирование исходного глюксаосодержаще- го раствора с термически стабилизированной глюкозоизомеразой проводят

-

1523056. при 90-115°С и 10-25 мин до превращения по крайней мере 54-58% глюкозы во фруктозу.

2, Способ по п. 1,отлича- ю щ и и с я тем, что используют химически стабилизированную глюкозо- изомерйзу,

Т а б л и ц а 1

43

152305644

Таблица 4

Изобретение относится к производству фруктозы путем ферментивной изомеризации глюкозы. Цель изобретения заключается в уменьшении образования псикозы и других несахаров в процессе изомеризации и повышение содержания фруктозы в растворе. Способ изомеризации глюкозы во фруктозу предусматривает контактирование исходного раствора с содержанием 40-50 мас.% глюкозы, например гидролизата крахмала, с термически стабилизированной глюкозоизомеразой при PH 6,0-7,0. Процесс изомеризации проводят при 90-115°С мин до превращения по крайней мере 54-58% глюкозы во фруктозу. Для изомеризации глюкозы следует использовать химически стабилизированную глюкозоизомеразу. 1 з.п. ф-лы, 11 табл.

Обработка раствора } Состав углеводов, мас,%, в расчете

на беззольную сухую массу

Фрук- I Глю Пси- Поли- Окраска трза I коза коза саха- (CIKFxlQO)

РИД

Неизомеризованный О 99,2 О 0,8 0,6

Изомеризованный

при ,3 46,9 О 0,8 0,7

Изомеризованный

прн 97,8 С 55,8 43,8 0,2 0,2 5,7

Таблица 5

Обработка раствора j Состав углеводов, мас.%, в расчете

на беззольную сухую массу

Фрук- I Глю- Пси- Поли- Окраска тоза Гкоза коза саха- (CIRFiflOO)

РИД

Неизомеризованный О 97,6 О 2,4 0,5

Изомеризованный

при 70 С51,3 . 46,4 О 2,3 0,7

Изомеризованный

при 102°С55,5 42,0 0,2 . 2,343,6

Таблицаб

Обработка раствора } Состав углеводов, мас.%, в расчете

на беззольную сухую массу

Фрук- Глю- I Пси- Поли- Окраска тоза I коза | коза | саха- (CIRFiflOO)

РИД

О 97,6 О 2,4 51,3 . 46,4 О 2,3 55,5 41,6 0,3 2,6

0,5 0,7 14,1

47

О96,9 О3,1

51,4 45,9 О2,7

55,4 42,0/ 0,1 2,5

152305648

Таблица 10

О О 8,5

Таблица 11