Изобретение относится к усовершенствованному способу получения амидов sLMpHO- или полифосфатов олигонуклео- тидов по концевой фосфатной группе, которые находят широкое применение в молекулярной биологии для исследования матричных реакций, особенно комплементарно адресованной модификации нуклеино вых кислот, а также в качестве аффинны реагентов. Известны способы получения амидов Б-монофосфатов олигонуклеотидов но концевой фосфатной группе с помощью дицикло гексилкарбодиимида 1 или дифенилхлорфосфата 2, Оба способа сопровождаются значител ной побочной реакцией по межнуклеотидным фосфатным группам, возрастающей с увеличением длины олигонуклеотида. Известен также способ получения амидов 5-моно- или полифосфатов олиго- нуклеотидов Уз, основанный на активации концевой фосфатной группы 5-моно- Фосфатов ОЛИ1Х)нуклеотидов п зевоащекием ее в смешанный ангидрид при действии избытка хлоранг1щр ща 2,4,6-триметилбенаойной кислоты в сухом пиридине в течение 20-ЗО мин и последующем взаимодействии смешанного ангвдрида с аминами в течение 2-3 суток в воде или 18-2О ч в сухом диметилформамиде. Выходы как смешанных анг1щридов, так и 5-амидов олигонуклеотидов составляют 6О-9О%, Синтезированные амиды выделяют хроматографией на бумаге. Но синтез 5-амвдов олигонуклеотидов - двух- стадийный процесс в разных растворителях, продолжительность реакции смешанных ангидридов олигонуклеотидов с аминами в воде 2-3 суток, в диметилформамиде 18-20 ч, т.е. значительная, к тому же синтез осложняется побочной реакцией по межнуклеотидным фосфатным группам, приводящей в рибо-серии к внутримолекуляргюму фосфорилированию 2-гвдроксила, а злтем к изомеризации или разрывам межнуклеотидной связи. Целью изобретения является упрощение процесса. Поставленная цель достигается тем, что амиды 5-моио- или полифосфатов рлигонуклеотидов по концевой фосфатной группе получают при проведении реакции в смеси три- или тетраалкиламмониевой соли 51моно- или полифосфатов олигонуклеотидов в сухом полярном алротонном растворителе (диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин), 3-5-кратного избытка конденсирующего агента - трифенилфосфина-2,2 -дипиридилдисульфида, и 5-1О-кратного избытка амина (). Процесс обычно идет в течение 2-4 ч при комнатной температуре. Целевые продукты выделяют обычными приемами; осаждением реакционной смеси в эфир или иОннообмешюй хроматографией. Выход целевого продукта В обоих случая не менее 80%. Пример 1. Синтез б пиперидида тридезокситимидилата. 21О OEjg (7,1 мкмоль) триэтил-аммониевой соли (dpT), растворяют в 0,2 мл сухого шфидина, добавляют к раствору 4 мкл (5О ммоль) пиперидина, 8 мг (30 ммоль) трифенилфосфина, 6,6 Мг (ЗО ммоль) 2,2-дипиридилдисульфида и вьщерживают в течение 3 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь добавляют к Ю мл эфира, осадок отделяют центрифугированием, промываю эфиром (3x5 мл), высушивают в вакуум Выход 170 OEj67 (88%). По данным микроколоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в системе ТомлинсонаТенера препарат содержит 96% целевого продукта и 4% (SpT)jj по данным тонкослойной хрюматографии на целлюлозных пластинках itastrnan-koflaK в системе изопропанол:аммиак:вода - 7:1:2 препарат содержит два вещества с Rf 0,75 (целевой продукт) и Rf 0,41 (dpTj, следы). Пример 2. Синтез |5 -морфолида 5-пирофосфата тридезокситимидилата. 1ОО ОЕ (3 ммоль) триэтиламмо;ниевой соли 5 -пирофосфата тридезокс.итимидилата (dppTpTpT) растворяют в О,1 мл диметилсульфоксида, добавляют к раствору 2 мкл (25 ммоль) морфолина, 5,4 мг (2О ммоль) трифенилфосфина, 4,4 мг (20 ммоль) 2,2-дипиридилсульфида и вьщерживают в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную :;месь разбавляют водой до 3 мл и кстрагируют эфиром (6x2 мл). Алик- воту водного слоя анализируют хроматографией на бумаге в системе этанол-1М адетат аммония, рН 7,5 (7;3), Обнару- жено два пятна с Rf 0,24 (деловой продукт) и ,08 (dppTpTpT, следы). По данным микроколоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в системе Томлинсона-Тенера препарат (водный слой) содержит 95% целевого продукта. Выход 82 ОЕ,67 (82%). Пример 3. Скнтез 5-бензнпамида дидезокситимидилата, 1ОО мг (0,11 ммоль) триэтиламмо- нийной соли (dpT) растворяют мл сухого пиридина, добавляют к раствору 1ОО мкл (0,9 ммоль) бензиламина, 66 мг (0,3 ммоль) 2,2-дипиридилдисульфида, 78 мг (0,3 ммоль) трифенилфосфина и вьщерживают в течение 2 ч при комнатной температуре, В спектре реакционной смеси наблюдают ся сигналы с химсдвигами + 1,9 м.д. (межнуклеотидный фосфат) и -7,1 м.д. (5-концевой амидоэфирный фосфат), соотношение интенсивностей 1:1, а также сигнал трифенилфосфинокиси (-25,7 м.д.). Реакционную смесь добавляют к 25 мл эфира, осадок отделяют центрифугированием, промывают эфиром (4x10 мл), высушивают в вакууме. Выход 1ОО мг (1ОО%). Гомогенность препарата подтверждается 1СА на пластинке SlCufoP в системе CHjCN-H2.O (4:1), R 0,33. Формула изобретения 1. Способ получения амидов 5-моно-или полифосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе в сухом полярном апротонном растворителе в присутствии амина (), отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, реакцию ведут в смеси три- или тетраапкиламмониевой соли 5-моно- или полифосфатов олигонуклеотидов, 3-5-кратного избытка трифенилфосфипа-2,2-дипиридилдисул14|ида и 5-1О-кратного избытка амина. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Соколова А, И., Гатинская Л. Г., Недбай В. К., Смирнов В. Д.,Рухляда П. И., Щэбяпова. 3. А. и Прокофьев М. А.
57214526
Синтез амидов олигонук.чеотвдов ДАН() феш1лаланина пирс4юсфатным меСССР (1971) 196 NO 3 с. 613-615.тодом, ЖОХ (1964) 34, с. 359-261.
2. Воробьев О. В., Шабарова З.А.,3.NucCetc Adds Re earchV 1976,
Прокофьев М.А. Синтез нуклеотияил3, fo 4, с. 903-916 (прототип).
