СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИД-5'-ТРИФОСФАТОВ Российский патент 1997 года по МПК C07H19/10 C07H19/20 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к способу получения химических веществ, конкретно дезоксинуклеозид-5¹-трифосфатов (dNTP) общей формулы

где M⁺ катион щелочного металла,
B тимин-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-9-ил или гуанин-9-ил.

Указанные соединения являются биологически активными и широко используются в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины.

Известные способы получения dNTP представляют собой многостадийные процессы, ключевой стадией которых является реакция активации фосфатной группы нуклеотида при помощи активирующего реагента, обычно в смеси в амином в органическом растворителе. После удаления избытка активатора из реакционной смеси полученный фосфамид далее обрабатывают неорганическим пирофосфатом и получают dNTP.

Известен способ получения dNTR [1] состоящий в активировании нуклеотида путем взаимодействия его с дициклогексилкарбодиимидом (ДЦК) и морфолином в водном третбутаноле при нагревании в течение 2 4 ч с последующим разложением ДЦК водой, экстракцией его эфиром и обработкой полученного морфолида нуклеотида раствором пирофосфата в диметилсульфоксиде в течение 2 4 сут. при комнатной температуре. Выход dNTP составляет 73-80% длительность процесса - 2-4 сут.

Недостатками известного способа являются низкая скорость и высокая трудоемкость процесса.

Известен способ получения dNTP [2] заключающийся в активировании нуклеотидов 1,1'-карбонилдиимидазолом в диметилформамиде при комнатной температуре в течение 4 ч, с последующим метанолизом избытка активатора и обработкой пирофосфатом в течение 1 дн. Выход dEIP 45-60% длительность процесса 28 ч.

Недостатками способа являются невысокий выход продукта и низкая скорость процесса.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения dNTP [3] состоящий из двух последовательных стадий:
реакция активирования нуклеотида при помощи пары трифенилфосфиндипиридилдисульфид (TPP-DPDS) и 4-(N,N-диметил)аминопиридина (DMAP) в диметилсульфоксиде-этаноле в течение 20 мин при комнатной температуре;
добавление к полученному DMAP-производному нуклеотида раствора пирофосфата в спирте, удаление последнего в вакууме и выдерживание реакционной смеси в течение 45-60 мин при комнатной температуре.

Выход продукта составляет 40-65% длительность процесса 65-80 мин.

Существенными недостатками известного способа являются:
недостаточно высокий выход целевого продукта;
относительно низкая скорость процесса;
высокая стоимость активирующего реагента TPP-DPDS и DMAP.

Задачей настоящего изобретения является увеличение выхода целевого продукта, скорости его образования и снижение его себестоимости.

Задача достигается тем, что соответствующий дезоксинуклеозид-5¹-монофосфат подвергают реакции с активирующим реагентом в органическом растворителе с последующим взаимодействием полученного активированного производного с три-н-бутиламмоний пирофосфатом и выделением целевого продукта в виде гидрата соли щелочного металла, при этом в качестве активирующего реагента используют трифторуксусный ангидрид (ТФА) с последующим удалением его избытка из реакционной смеси, а затем N-метилимидазол, а в качестве органического растворителя используют апротонный растворитель в присутствии третичного амина.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем:
Нуклеотид суспендируют в апротонном растворителе, выбранном предпочтительно из группы: ацетонитрил, N,N-диметилформамид (ДМФ), хлороформ в присутствии третичного амина (триэтиламин, N,N-диметиланилин, пиридин) и добавляют раствор ТФА в том же растворителе при перемешивании и охлаждении. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре до растворения нуклеотида, удаляют избыток ТФА в вакууме, добавляют N-метилимидазол и третичный амин и далее полученное активированное производное обрабатывают раствором три-н-бутиламмоний пирофосфата в апротонном растворителе и выделяют продукт известными методами (схема).

а) B=B^Tfa тимин-1-ил;
б) B=цитозин-1-ил, B^Tfa=N4-трифторацетилцитозин-1-ил;
в) B=аденин-9-ил, B_Tfa=N6-трифторацетиладенин-9-ил;
г) B=гуанин-9-ил, B^Tfa N2-трифторацетилгуанин-9-ил;
R₃N (C₂H₅)₃N; .

Выход целевого продукта (IV а-г) составляет 87 92% длительность процесса 25 30 мин.

Отличительными признаками заявляемого способа являются:
Активирование нуклеотида при помощи трифторуксусного ангидрида с последующим удалением его из реакционной смеси и обработкой полученного смешанного ангидрида (II а-г) N-метилимидазолом. Это позволяет увеличить скорость реакции пирофосфорилирования за счет большей реакционной способности метилимидазолида (III а-г) по сравнению с DMAP-производным нуклеотида в прототипе. Применение ТФА, более дешевого чем пара TPP-DPDS, позволяет снизить стоимость целевых dNTP, а также упростить его удаление из реакционной смеси (ТФА легко улетает при выдерживании в вакууме, т.кип. 38^oC). Способность ТФА временно блокировать OH- и NH₂-группы нуклеотида позволяет ускорить реакцию активирования за счет увеличения растворимости трифторацетильного производного нуклеотида в органическом растворителе.

Реакцию активирования проводят в апротонном растворителе в присутствии третичного амина, что обеспечивает стабильность лабильных реагентов ТФА и ангидрида (II а-г), а также исключает закисление среды ионами водорода, выделяющимися в процессе реакции.

В известных научно-технических и патентных источниках сведений с применением ТФА в сочетании с N-метилимидазолом для получения dNTP заявителем не обнаружено.

Пример 1. Тимидин-5¹-трифосфат (IVа).

К суспензии тимидин-5¹-фосфорной кислоты (0,322 г, 1 ммоль) в ацетонитриле (2 мл) добавляют триэтиламин (0,7 мл, 5 ммоль) и при охлаждении в водяной бане (15±5^oC) и перемешивали раствор ТФА (0,7 мл, 5 ммоль) в 1 мл ацетонитрила в течение 1 2 мин. Смесь перемешивают до растворения нуклеотида при комнатной температуре в течение 5 10 мин и выдерживают в вакууме 5 10 мин для удаления избытка ТФА. Остаток обрабатывают N-метилимидазолом (0,24 мл, 3 ммоль) и триэтиламином (0,28 мл, 2 мл), выдерживают 2 5 мин и добавляют 1 M раствор ди(три-н-бутил)аммоний пирофосфата в ацетонитриле (4 мл, 4 ммоль). Через 5 мин смесь обрабатывают 25% NH₄OH (1 мл) и 70% водным метанолом (4 мл). Осадок аммоний пирофосфата отфильтровывают, промывают 70% водным метанолом (3х3 мл), фильтрат упаривают в вакууме и продукт выделяют ионообменной хроматографией (колонка 1,1 х 10 см, DEAE-сефадекс A-25 в HCO-3

-форме, элюент 0,1 0,6 M NH₄HCO₃). Осаждение продукта раствором NaClO₄ в ацетоне дает 0,57 г (92%) Na₄ соли тригидрата трифосфата (IVа). ¹H-ЯМР-спектр (прибор WP-200, частота 200,13 Мгц, D₂O, 30^oC, внешний стандарт TMS, δ, м.д.):7,51c(1, H6); 6,11т(1, H1^I); 4,44 м (1, Н3^I); 3,70 м (3, H4^I5^I5^II); 2, 15 м (2, H2^I2^II); 1,69c(3,CH₃). ³¹P-ЯМР-спектр (прибор AC-200, частота 81,015 Мгц, DMF, 25^oC, внешний стандарт 85% H₃PO₄, d, м.д.): -6,33 д (1, P_γ; -10,80 д (1, P_α; -21,66 т (1,P_β). УФ-спектр (вода, pH 7,5): l_max267 нм (9600); отношения A₂₅₀/A₂₆₀ 0,642; A₂₈₀/A₂₆₀ 0,782; A₂₉₀/A₂₆₀ 0,283. Данные анализа MKX (Polisil CA, 5 мм, 0 0,3 M K-фосфат, pH 7,5, 30% CH₃CN): dTTP 96,6% моно-, ди- и полифосфаты - 0,18% 2,3% 0,92% соответственно.

Пример 2. Дезоксицитидин-5¹-трифосфат (IYб).

К суспензии дезоксицитидин-5¹-фосфорной кислоты (0,307 г, 1 ммоль) в диметилформамиде (2 мл) добавляют пиридин (0,48 мл, 6 ммоль) и далее обрабатывают ТФА как описано в примере 1. После удаления ТФА смесь обрабатывают N-метилимидазолом (0,24 мл, 3 ммоль) и триэтиламином (0,84 мл, 6 ммоль), выдерживают 2-5 мин и добавляют 1 М раствор ди(три-н-бутил)аммоний пирофосфата в ацетонитриле (4 мл, 4 ммоль). Продукт далее выделяют как описано в примере 1, получая 0,55 г (90%) Na₄-соли тригидрата трифосфата (IYб) ¹H-ЯМР-спектр (в условиях примера 1): 7,74д(1,H6); 6,07т(1, H1¹); 5,91д (1,H5); 4,37м(1, H3¹); 3,97м(3, H4¹5¹5¹¹); 2,14м(2, H2¹2¹¹). УФ-спектр (H₂O, pH 7,5): λ_max 272нм(9100), А₂₅₀/A₂₆₀0,857; A₂₈₀/A₂₆₀1,058; A₂₉₀/A₂₆₀ 0,428. МКХ-анализ (в условиях примера 1): dCTP 95,1% моно-, ди- и тетрафосфаты 1,6% 2,5% и 0,8% соответственно.

Пример 3. Дезоксиаденозин-5¹-трифосфат (IYв).

К суспензии дезоксиаденозин-5¹-фосфорной кислоты (0,331г, 1 ммоль) в ацетонитриле (3,5 мл) добавляют триэтиламин (0,28 мл, 2 ммоль), диметиланилин 0,51 мл, 4 ммоль) и при перемешивании и охлаждении до 2-5^oC в течение 5 мин добавляют раствор ТФА (0,7 мл, 5 ммоль) в ацетонитриле (1,5 мл). Смесь перемешивают до растворения осадка в течение 5-10 мин при комнатной температуре и далее синтез проводят как описано в примере 1. Получают 0,56г (88%) Na₄-соли тригидрата dATP (IYв). ¹H-ЯМР-спектр (в условиях примера 1): 8,15с(1, H8); 7,82с(1, H2); 6,15т(1, H1¹); 4,52м(1,H3¹; 4,01м(3,H4¹5¹5₁₁); 2,51м(1, H2¹); 2,39м(1, H2¹¹). УФ-спектр (H₂O, pH 7,5): λ_max 260нм(15400), A₂₅₀/A₂₆₀ 0,778; A₂₈₀/A₂₆₀ 0,187; A₂₉₀/A₂₆₀ 0,009. МКХ-анализ (см. пример 1): dATP 95,2% моно-, ди- и тетрафосфаты 3,2% 0,8% и 0,4% соответственно.

Пример 4. Дезоксигуанозин-5¹-трифосфат (IYг).

К суспензии дитриэтиламмониевой соли дезоксигуанозин-5¹-фосфата (0,55г, 1 ммоль) в ацетонитриле (3,5 мл) добавляют триэтилами (0,28 мл, 2 ммоль) и N, N-диметиланилин (0,51 мл, 4 ммоль) и далее обрабатывают как описано в примере 3. Получают 0,56 г (87%) Na₄-соли тригидрата dGTP (IYг). ¹H-ЯМР-спектр (в условиях примера 1). 7,82с(1,H8); 5,99т(1,H1¹); 4,52м(1,H3¹); 3,99м(3, H4¹5¹5¹¹); 2,46м(1,H2¹); 2,30м(1,H2¹¹). УФ-спектр (H₂O): λ_max 252 нм(13700); A₂₅₀/A₂₆₀ 1,122; A₂₈₀/A₂₆₀ 0,654; A₂₉₀/A₂₆₀ 0,302. МКХ-аналих (в условиях примера 1): dGTP 95,0% моно-, ди- и тетрафосфаты 1,1% 3,1% и 0,8% соответственно.

Для получения любой соли dNTP достаточно воспользоваться известными методами ионообменной хроматографии, например, хроматографией на катионообменных смолах типа Dawex 50wx2 или КРС.

Пример 5.

Синтез тимидин-5¹-трифосфата ведут аналогично описанному в примере 1. После выделения инообменной хроматографией раствор аммониевой соли в воде (5 мл) наносят на колонку, содержащую 10 мл смолы Dawex 50Wx2 (Li⁺), после элюции продукта водой и лиофилизации водного раствора получают 0,51 г (95%) дигидрата тетралитиевой соли тимидин-5¹-трифосфата.

Аналогично получают с любым катионом, в том числе в виде алкиламмониевой соли и т.д.

Использование предлагаемого способа получения dNTP обеспечивает следующие преимущества:
увеличение выхода целевого продукта до 97-92%
снижение времени проведения процесса до 30 мин;
снижение стоимости активирующего реагента в 15 раз (1 моль пары трифенилфосфин-дипиридилдисульфид стоит 730 $, а 1 моль ТФА 48 $).

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности, к способу получения дезоксинуклеозил-5¹-трифосфатов общей формулы: где B - тимин-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-1-ил или гуанин-1-ил, которые широко используются в молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. С целью увеличения выхода целевого продукта, скорости его образования и снижения себестоимости процесса указанные соединения получают путем реакции соответствующего дезоксинуклеозид-5¹-монофосфата с активирующим реагентом и взаимодействия полученного активированного производного с три-н-бутил-аммоний пирофосфатом, при этом в качестве активирующего реагента используют сначала трифторуксусный ангидрид с последующим удалением его избытка из реакционной смеси, а затем -N-метилимидазол. Реакцию активирования ведут в апротонном растворителе в присутствии третичного амина. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов общей формулы

где М⁺ катион щелочного металла, В тимин-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-9-ил или гуанин-9-ил,
включающий реакцию соответствующего дезоксинуклеозид-5'-монофосфата с активирующим реагентом в органическом растворителе с последующим взаимодействием полученного активированного производного с три-н-бутиламмоний пирофосфатом и выделением продукта в виде гидратов щелочных металлов, отличающийся тем, что в качестве активирующего реагента используют трифторуксусный ангидрид с последующим удалением его избытка из реакционной смеси, а затем N-метилмидазол, при этом в качестве органического растворителя используют апротонный растворитель в присутствии третичного амина. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве апротонного растворителя используют ацетонитрил, N,N-диметилформамид или хлороформ. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве третичного амина используют триэтиламин, N,N-диметиланилин или пиридин.