Способ получения 5-или 3-фосфоамидов моно-или олигонуклеотидов Советский патент 1983 года по МПК C07H19/04 A61K49/00 C07H21/00 

4 «ЭР Изобретение относится к способу получения осФоамндов моно- или оли гонуклеотидов, которые широко используются в биоорганической химии и молекулярной биологии в качестве исходных соединений для получения соответствующих ди- и трифосфатов, реагентов .для аффинной модификации белков и нуклеиновьГх кислот, а также для химической сборки полинуклеотидов в матрично-направленных р еакциях. Кроме того, соединения этого класса, содержащие в своем составе остаток аминокислоты или пептида, используются в молекулярно-биологических исследованиях в качестве моделей природных нуклеопротеидов. Известен способ получения з- или 3 -фосфоамидов моно- или олигонуклео тидов путем взаимодействия смешанных ангидридов с мезитиленкарбоновой кис лотой С 1 }. Сначала получают смешанный ангидрид нуклеотида и мезитиленкарбоново кислоты при действии хлорангидрида кислоты в безводном пиридине, затем избыток реагента удаляют экстракцией эфиром и к остатку добавляют аг/шн либо в водном, либо в безводном раст воре. Если aMtiH добавляют безводным, процесс заканчивается через несколько часов, а в водной среде - -через 2-3 сут. Для проведения первой стадии - получения смешанного ангидрида необходимо предварительно переводить моно-г или олигонуклеотид в соответствующую растворимую в пиридине форму, например, три-н- алкиламг-ганиевую. Этот способ практически нельзя приме нять для пoлyчe ия амидов олигонукле отидов риборяда, так как в результате ацилирования межнуклеотидних фосфатных групп в значительной мере про исходит разрыв и изомеризадр я межнук леотидних связей. Кроме того,при работе со слабыми af4HHatvM эффективность способа заметно понижает ся. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения 5-или З-фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, заключающийся в конденсации нуклеотидной компоненты (пиридиниевой или три-н-алкиламмонийной соли моно- или олигонуклеотида ) с безводным амином.в безводном органическом растворителе (безводный пиридин или диметилформаглид ) в присутствии производного карбОдиимида (дициклогексилкарбодиимида ). Процесс протекает в течение 2-3 сут при 37-. Выход целевого продукта 50-80% 2 . Недостатком известного способа по лучения является относительно низкий выход целевого продукта. При длитель ном выдерживании олигонуклеотидов в безводных растворителях в присутствии дициклогексилкарбодиим да происходит нежелательная модификация межнуклеотидных фосфатных групп, причем степень модификации возрастает с увеличением длины олигонуклеогида. Недостатком способа является также необходимость проведения процесса в безводном растворителе, так как для крупных олигонуклеотидных блоков . практически невозможно количественно перевести олигонуклеотид Врастворимое в органическом растворителе состояние . Кроме того, указанный способ не дает возможности получать амиды, содержащие в своем составе остатки сильных аминов, значение рК которых более 10, что связано, с одной стороны, с плохой растворимостью о.чигонуклеотидов при добавлении таких аминов и с другой стороны, с низкой реакционной способностью дициклогексилкарбодиимида в присутствии сильных амиЦелью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Цель достигается согласно способу получения 5- или 3-фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, заключаю(емуся в конденсации в водной среде водорастворимых солей нуклеотидов с водным раствором амина с рН 4,5-10 при условии, что рН раствора амина на ,1 меньше РК амина, в присутствии конденсирующего агента - 1-этил-3-(З-диметиламинопропил )карбодиимида. Выход целевого продукта 85-100%. При рН, меньашх 4,5, начинается конкурентная реакция гидролиза образующегося фосфоамида, в результате чего вьлход фосфоамида понижается. Существенныг4И отличиями предлагаемого способа получения является использование в качестве нуклеотидной компоненты водорастворимых солей нуклеотидов, в качестве растворителя воды, в качестве производного карбодиимида-1-этил-З-(З-диметиламинопропил )-карбодиимид, в качестве аминной компонентЕз - водного раствора амина с рН 4,5-10, при условии, что рН раствора амина на 1±0,1 меньше рК амина. Пример 1. К1 мкмоль N а-соли (10 , упаренный до масла , водный раствор добавляют 100 мкл 3 М водного раствора имидазола (рКд 7,0), предварительно титрованного с помоцью б н. водной соляной кислоты до рН 6,0. Затем добавляют -10 мг (50 мкмоль ) 1-этил-3-(З-диметиламинопропил )кapбoдии /IИдa и через 2 ч при 20°С полученную смесь фракционируют с помощью электрофореза на бумаге в 0,05 М три этил амг юнийном буфере с рН 7,5-8,0. Выход имидазольного производного дезокситимидиловой кислоты практически количественный. Полученное соединение идентифицируют с образцом, полученным ранее другим способом. П р и м е р 2. Водный раствор c3(TC,G,CCAAGerp)M н - соли, содержа щий 1 OE2fQ, 10 нмоль вещества, упаривают до масла, добавляют 100 мкл 3 М водного раствора морфолина рК 8,3), предварительно титрованного с помощью 6 н. водной-HCl до рН 7,25. Зате. добавляют 10 мг {50 мкмоль| 1-этил-З- (З-диметилаг-шнопропил/карбо диимида и после выдерживания получен ной смеси в течение 5 ч при 20°С олигонуклеотидную фракцию выделяют из смеси путем гель-фильтрации на биогеле Р-2. Анализ олигонуклеотидов выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменной смоле, свидетельствует о том, что морфолид декануклеотида получают с выходом 90%. Пример 3.-Водный раствор (pA-j ) в виде Na-соли (2 20 нмольj упаривают до масла и до-, бавляют 100 мкл имидазола (,о) титрованного до рН 6,0 с помощью 6 н. водного раствора соляной кислоты. Затем добавляют 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-З-(3-диМетиламинопропил)-карбодиимида и после выдерживания полученной смеси в течение 3 ч при 20 °С олигонуклеотиды обессоливают методом гель-фильтрации на биогеле Р-2. Анализ олигонуклеотидной фракции, выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменнике, свидетельствует о том, что имидазолид гептаадениловой кислоты получают с выходом 85%, Данные для других примеров получения амидов моно- и олигонуклеотидов представлены в таблице.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5- ИЛИ 3-ФОСФОАМИДОВ .МОНО- ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕО-, ТИДОВ, путем конденсации нуклеотидной компоненты с аглинной в растворителе в присутствии производного кapбoдии шда, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта в качестве нуклеотидной компоненты используют водорастворимые соли нуклеотидов, в качестве растворителя. воду, в качесЗтве производного карбодиимида - 1-этил-З-(З-лиметиламинопропил )карбода1имид, в качестве аминной компоненты - водный раствор ами|На с рН 4,5-10, при условии, что рН с раствора амина на It0,1 меньше рК (Л амина.

Примечание. Во всех случаях, указанных в таблице, концентрация

карбодиимида 0,5 М, концентрация амина - 3 М,-реакционная среда - вода.

Приведенный пример. К раствору . амида добавляют 17 мкл (0,2 ммольj 4 мг (0,01 ммоль } пиридиниевой соли . морфолина и 20 мг (0,1 ммоль ) дицикdfpT в 0,2 мл безводного диметилформ- 5 логексилкарбодиимида. Реакционную

S1049498®

смесь выдерживают 3 сут при комнат-фильтровывают и из водного слоя метоной температуре и добавляют 0,5 млдом бумажной хроматографии или элекводы. Через 10 ч избыток карбодиими-,трофореза выделяют морфолид дезоксидй экстрагируют эфиром, мочевину от-тимидиловой кислоты с выходом 50%,