Способ производства итаконовой кислоты Советский патент 1980 года по МПК C12D1/02 

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно к способу производства итаконовой кислоты, используемой для изготовления моющих средств, ионитов, инсектицидов, присадок, красителей и ряда сложных органических соединений. Известны способы производства итаконовой кислоты путем поверхнос ного выращивания продуцирующих ее микроорганизмов, например Aspergil terreus, на питательных средах, со держащих в качестве источника углерода мелассу 1 , сахар-сырец (тростниковый) 2 и другие необходимые минеральные соли, кислоты, с последующим выделением целевого продукта. Однако применение, например, ме лассы, требует дополнительных затрат на обеспечение.стерильности пр изводства, поскольку заражение пос ронней микрофлорой ведет с снижени выхода кислоты. Использование дорогостоящего сахара-сырца приводит к повышению себестоимости,целевого продукта. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ производства итаконовой кислоты путем поверхностного выращивания продуцирующих ее микроорганизмов на питательной среде, содержащей источник углерода с добавлением необходимых для роста минеральных солей, кукурузного экстракта и минеральных кислот, с последующим выделением продукта упариванием раствора, фильтрующей кристаллизацией, выделеиием кристаллов и сушкой 3, Недостатком известного способа является недостаточно высокий выход кислоты, остаточного сахара в пленке мицелия, что приводит к ее быстрому разрыву и затрудняет съем мицелия с кювет бродильных камер . Целью изобретения является увеличение выхода итаконовой кислоты, снижение содержания остаточного сахара в сброженных растворах и тем самым упрощение процесса благодаря получению более эластичнойГи легко снимаемой пленки мицелия с меньшим количеством биомассы, что облегчает

сбор мицелия по окончании ферментации .

Поставленная цель достигается тем, что в качестве источника углерода используют технический гликокол в количестве 50-75% в пересчете на сахаристые вещества.

Смесь сахара-песка 35 г, технического гликокола, отмьттого от хлоридов 35 г, аммиачной селитры 2,5 г, кукурузного экстракта 0,2 г, цинка сернокислого 0,0044 г, калИя фосфорHQ-кислого однозамещенного 0,001 г помещают в колбу на 1 л, доводят до метки водопроводной водой и тщательно перемешивают.

Подкисляют концентрированной азотной кислотой до рН 2,1 (предел 2,02,3), закрывают ватно-марлевой пробкой и стерилизуют (на электроплитке кипятят 10 мин). Охлаждают до 40° С и разливают в стерильные стаканы, предварительно обработав инструменты и рабочий сТол 70%-ным спиртом гидролизным высшей очистки.

Параллельно готовят контрольнЪай раствор, используя 70 г/л.сахара-песка и те же количества остальных реактивов, но без добавки гликокола.

Разливают питательно-бродильные растворы в стерильные стаканы по четыре стакана на каждый опыт (четыре параллели),

Растворы разливают быстро, обжигая над Спиртовкой края колб, стаканов и цилиндров. Раствор из цилинра выливают в каждый стакан по 170 мл, чуть приподнимая края ватником.

Затем быстро над горячей спиртовкой и факелом производят посев спор гриба Aspergillus terreus с помощью пульверизатора. Стака:ны, закрытые ватником, ставят на протертый спиртом поднос, заносят в термокамеру и ставят на стеллажи.

(При заходе в термокамеру соблюдаются все правила стерильности).

Термокамера предназначена для проведения ферментации (сбраживания) бродильных растворов в лабораторных условиях.

В т.ермокамере поддерживают постояную температуру 35-37 С, 3-кратный обмен воздуха по объему камеры.

После сформировывания нормального мицелия (через двое суток на третьи) npoifзводят-долив раствора под пленку Шцелия.

. Дли этого готовят по- 2 л испытуемого и контрольного растворов.

Контрольный раствор, используемый для долива содержит сахар-песок кристаллический, пищевой 120 г/л, магний хлористый 0,75 г/л и азотную кислоту до рН 2,1,

Подготовку растворов для долива и их стерилизацию производят, как и приготовление растворов при наливе.

Затем растворы охлаждают до 30-32 т.е. ниже температуры, чем при на- ливе, чтобы не обжечь живой мицелий.

Долив производят в термокамере стерильно. Для этого со стаканов снимают ватники и быстро, но осторожно, наклонив и поворачивая стакан, чтобы не повредить мицелий на поверхности, производят долив до 340 мл в каждый стакан, что соответствует высоте слоя 8 см.

В течени-е последующих дней визуально наблюдают за ростом мицелия.

Если в каком-либо стакане появится заражение, его накрывают ватником выносят из термокамеры и автоклавируют.

Во время ферментации заражения и,спытуемьр образцов не было.

Мицелий серовато-белого цвета мелко извилистый, эластичный, тонкий, мало биомассы, расхождения в характеристиках мицелия в-параллелях опыта нет.

После первых анализов из термокамеры (на- восьмые-девятые сутки) определяют возможность проведения дополнительного долива (подлив под мицелий).

В случае плотного незараженного мицелия и при нормальномкислотообразовании (определяют на анализу пробы при заходе) делают подлив следующего состава, мп/л: сахар-песок 25, гликокол 25.

Спустя 13-15 суток от начапа брожения цикл кислотообразования заканчивают.

По окончании рпыта сброженный раствор из каждого стакана сливают отдельно и проводят контрольные анализы.

Количественное определение содержания итаконовой кислоты ведут по методу Фридкина, основанному на изменении поглощения брома итаконовой кислотой в забуферной бромной воде; определение общей кислотности - по методу нейтрализации в сброженном растворе итаконовой кислоты 0,1 N н. едким натром в присутствии фенолфталеина; определение сахара - по методу окисления сахара испытуемого pacTBoipa в щелочной среде окисью меди путем обратного титрования (реактив-окислитель, содержащий медь Фалингова жидкость).

Результаты опытов приведены в таблице. Подлив - 50 г/л сахара-песка. Подлив - 25 г/л сахара-песка, 25 г/л до рН 2,1,

Во всех опытах состав налива, г/л магний хлористый 0,75, аммиачная селитра 2,5; цинк сернокислый 0,0044, калий фосфорнокислый однозамещенный О,001,кукурузный экстракт 0,2, азотная кислота до рН 2,10, Состав долива: магний хлористый 0,75 г/л, азотная кислота до рН 2,05. Количества сахара и гликокола указаны в таблице.

. Далее сброженные растворы упаривают в лабораторных условиях под вакуумом 0,8±0,1 кгс/см, поддерживая температуру .

Упаривание производят до концентрции по общей кислотности- 37-39,5% и по сахару не более 2,3%.

Общую кислотность и содержанирсахара определяют расчетным путем, исходя из объема и концентрации раствора для упаковки.

Упаренный раствор кристаллизуют для получения технической итаконовой кислоты при 8±2°С.

После отжима кристаллы технической итаконовой кислоты растворяют в дистиллированной воде до концентрации 25%, добавляют активированный уголь (10-11% от веса итаконовой кислоты).

Осветление проводят при постоянном перемешивании с подогревом до 87+2°С с последующей 40-мин выдержкой .

Горячий осветленный раствор фильруют на вакуум-фильтре для отделени угля.

Очищенный раствор товарной итаконовой кислоты (без следов желтизны и полном отсутствии угля) кристаллизуют при 8-2° С и фильтруют.

Отжатые кристаллы итаконовой кислоты сушат и анализируют. Товарная итаконовая кислота, полученная в лабораторных условиях, соответствует ТУ 6-09-2522-74 по всем показателям.

0

Выход товарной итаконовой кислоты составляет 70% от технической кислоты.

Из таблицы видно, что при введении гликокола в налив, долиЬ и

5 подлив увеличивается выход5 итаконовой мислоты более чем на 10%, уменьшается содержание остаточного сахара, уменьшается в среднем на 15% количество биомассы мицелия.

Пленка мицелия более эластичная,

0 легче снимается после окончания фе{зментации.

Формула изобретения

5

Способ производства итаконовой кислоты путем поверхностного выращивания продуцирующих ее микроорганизмов на питательной среде, содер0жащей источник углерода с добавлением необходимых для роста минеральных солей, кукурузного экстракта и минеральных кислот, с последующим выделением продукта упариванием раст5вора, фильтрацией, кристаллизацией, в(аделением кристаллов и сушкой, отличающийся тем, что с целью повьЕления выхода итакэновой кислоты, снижения содержания остаточного сахара в сброженных раство0рах, и тем самым упрощения процесса, в качестве источника углерода используют технический гликоколВ количестве 50-75% в пересчете на сахаристы вещества. гликокола, азотная кислота

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР 216579, кл, С 12 D 1/02, 1967.

2,Авторскоесвидетельство СССР 282250, кп, С21 D 1/02, 1968.

3.Авторскоесвидетельство СССР 507633, кл. С12 D 1/02, 1974 (прототип).