ШТАММ Aspergillus niger - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2015 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается селекции нового штамма гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты для ферментации глубинным способом сахарозо-минеральных сред и сред, приготовленных из гидролизатов крахмалсодержащего сырья.

Известен штамм микромицета Aspergillus niger F-696 (Патент РФ №2078810, 1997), который ферментирует в лимонную кислоту сахарозо-минеральные питательные среды и среды, приготовленные из гидролизата крахмала. Однако выход лимонной кислоты от сахара при использовании этого штамма в глубинных условиях недостаточно высок и составляет на сахарозо-минеральной среде 87,6%. Штамм ферментирует гидролизаты крахмала по технологии с дополнительным введением сахара в процессе ферментации, в результате чего увеличивается количество затраченного сахара за цикл, что влияет на выход лимонной кислоты - 82,8%.

В качестве прототипа выбран известный штамм микромицета Aspergillus niger F-501. (Патент РФ №1811697, 1991), предназначенный для глубинного культивирования на сахарозо-минеральных средах. Недостатком штамма является невысокая интенсивность биосинтеза лимонной кислоты с единицы объема среды в сутки - 18,2 г/(дм³·сут) и недостаточно высокий выход лимонной кислоты от затраченного сахара - 82,2%.

Изобретение направлено на получение нового генетически устойчивого штамма, обладающего более высокой активностью биосинтеза лимонной кислоты при ферментации сахарозо-минеральных сред и сред, приготовленных из гидролизатов различных видов крахмалсодержащего сырья.

При культивировании на сахарозо-минеральной среде в глубинных условиях новый штамм образует лимонную кислоту с выходом от затраченного сахара 90,5%, что значительно превосходит прототип - штамм ВКПМ F-501. При ферментации на средах, приготовленных из гидролизатов крахмалсодержащего сырья, в глубинных условиях за 4,5-5 сут ферментации новый штамм продуцирует лимонную кислоту с достаточно высоким выходом от затраченного сахара 84,7-99,3% (табл.1).

Новый штамм микромицета Aspergillus niger получен из штамма Aspergillus niger ВКПМ F-171 с использованием химических мутагенов (диэтилсульфата) и под действием облучения УФ-лучами в дозе 2,8 тыс. эрг/мм² в сочетании с отбором устойчивых спонтанных вариантов.

Новый селекционированный штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM 02149.

Штамм идентифицирован по культурально-морфологическим (размер и цвет колоний, вид мицелия и конидиальных головок) и физиолого-биохимическим (интенсивность биосинтеза лимонной кислоты на крахмалсодержащих средах) свойствам. Свойства представлены в таблице 1.

Штамм Aspergillus niger RCAM 02149 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Культурально-морфологические признаки идентифицируют у пятисуточных культур, выращенных на сусло-агаровой среде.

Колония в диаметре в среднем 81 мм светло-бежевого цвета. Воздушный мицелий сильно развит. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 8 мм светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая белая.

Конидиальные головки круглой формы диаметром от 40 до 125 мкм. Вздутие конидиеносца (пузырек) шаровидной формы размером от 33 до 65 мкм. Стеригмы двуслойные: длина стеригм первого слоя - от 12 до 44 мкм, второго слоя - от 10 до 16 мкм. Конидии круглые с толстой шиловидной кремовой оболочкой. Средний диаметр конидий 4,5 мкм. Конидиеносцы прямые, бесцветные, их длина - от 510 до 1410 мкм, ширина - от 11 до 22 мкм.

Штамм Aspergillus niger RCAM 02149 отличается от известного бежевого штамма F-501 более мелкими колониями (81 мм в отличие от 94 мм) и имеет большую величину морфологических структур (длина конидиеносца, стеригмы второго слоя, конидии).

Физиолого-биохимические признаки

Новый штамм Aspergillus niger RCAM 02149 является аэробом, прототрофом, имеет оптимальную температуру роста 32°C. Температурный диапазон роста 28-36°, оптимумом pH 1,7-7,0.

Отношение к источникам азота

Усваивает азот органических соединений (пептон, белок, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мицелиальную массу, мочевину), ассимилирует азот минеральных соединений - соли аммония, нитраты.

Отношение к источникам углерода

Хорошо усваивает углеводсодержащие источники и растет на мелассе, сахарозе, глюкозе, гидролизатах крахмала, гидролизатах муки из зерна (ржи, риса) и гидролизатах зерновых помолов (ржи, пшеницы, риса), содержащих глюкозу, мальтозу, декстрины.

Новый штамм хранится в виде воздушно-сухих конидий с остаточной влажностью не более 10% при постоянной комнатной температуре и относительной влажности воздуха, не превышающей 75%. Не допускается воздействие прямых солнечных лучей.

По сравнению с известным штаммом штамм RCAM 02149 при ферментации сахарозо-минерального и крахмалсодержащего сырья синтезирует значительно больше лимонной кислоты (см. таблицу 2).

Сущность изобретения поясняют конкретные примеры использования RCAM 02149.

ПРИМЕР 1

Для лабораторных испытаний посевной материал выращивают в пробирках на скошенном сусло-агаре. Для полупроизводственных и производственных испытаний посевной материал выращивают в кюветах на плотной питательной среде, приготовленной на основе неохмеленного пивного сусла, содержащего 7% сухих веществ, и уплотненной агар-агаром (20 г/дм³) pH среды 5,8. Высота слоя среды 12-13 мм.

Стерильную среду засевают конидиями культуры гриба и выдерживают в термостате при 32°C в течение 7 суток. Относительную влажность воздуха в термокамере постепенно снижают: первые четверо суток - 80%-60%, последние трое суток - 60%-40%. Через 7 суток конидии снимают с поверхности грибных пленок в кюветах при помощи специального вакуумного устройства. Для полного созревания и подсушивания пробирочную культуру гриба выдерживают при комнатной температуре в течение 2-х суток. Влажные конидии с кювет подсушивают до остаточной влажности 5-10%. Хранят при комнатной температуре.

Процесс ферментации в лабораторных условиях проводят глубинным способом в колбах вместимостью 750 см³ на встряхивающем аппарате с числом оборотов 160-180 мин^-1.

Основным сырьем для приготовления питательных сред является сахар-песок.

Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия:

50,0 г сахара-песка, 0,16 г дигидроортофосфата калия, 2,50 г нитрата аммония, 0,25 г сульфата магния гептагидрата, 17 г свекловичной мелассы (для стимуляции роста) растворяют в 1 дм³ водопроводной воды. Питательную среду стерилизуют в автоклаве текущим паром 15 мин и при избыточном давлении 0,05 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 32°C.

Культурой гриба, выращенной на сусло-агаре в течение 10 суток, или воздушно-сухими конидиями (10⁷ конидий/см³ среды) засевают 50 см³ питательной среды и выращивают посевной мицелий в течение 36 ч при температуре 32°C.

Посевным мицелием в количестве 10 см³ засевают 50 см³ ферментационной среды и проводят ферментацию в течение 6 сут при температуре 32°C. Состав ферментационной среды отличается от состава питательной среды увеличенным до 150 г/дм³ содержанием сахара без добавления мелассы. В процессе ферментации доливы питательной среды не производятся. После окончания цикла культуру гриба инактивируют кипячением в течение 3-х мин и определяют количество лимонной кислоты, выход ее от сахара, съем лимонной кислоты с единицы объема среды за сутки ферментации. Данные представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 2

Приготовление посевного материала нового штамма питательной среды для выращивания посевного мицелия и выращивание посевного мицелия проводят аналогично примеру 1.

Ферментацию питательной среды осуществляют при температуре 32°C в течение 4,5 сут.

Основным сырьем для приготовления ферментационной среды является ржаная мука.

Приготовление суспензии препарата «Целловиридин»:

1 г препарата «Целловиридин» с активностью 4000 ед. КМЦС/г растворяют в 5 см³ водопроводной воды, выдерживают при температуре 20°C в течение 30 мин и доводят объем до 50 см³.

Приготовление суспензии препарата «Амилосубтилин»:

1 г препарата «Амилосубтилин» с активностью 1000 ед. АС/г растворяют в 5 см³ водопроводной воды, выдерживают при температуре 20°C в течение 30 мин и доводят объем до 50 см³.

Приготовление питательной среды для ферментации:

232 г ржаной муки заливают водопроводной водой при температуре 20°C, доводят объем до 500 см³ и выдерживают при температуре 20°C в течение 16 ч, затем нагревают до 40°C, получая 44,2 мас.%-ную суспензию ржаной муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 14:1, и вводят суспензию ферментного препарата «Целловиридин» в количестве 2,5 см³ с содержанием карбоксиметилцеллюлазы 0,05 г, что соответствует дозировке 0,00025 г на 1 г сырья. Суспензию при постоянном перемешивании выдерживают при 40°C в течение 60 мин, вводят препарат «Амилосубтилин» в количестве 17,4 см³ с содержанием α-амилазы 0,348 г, что соответствует дозировке препарата 0,0015 г на 1 г сырья. При постоянном перемешивании доводят температуру до 85°C и выдерживают при этой температуре 60 мин. Для прекращения действия ферментного препарата полученный гидролизат нагревают до 95°C, охлаждают до 20°C.

Затем гидролизат ржаной муки стерилизуют в автоклаве текущим паром 15 мин и при избыточном давлении 0,08 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 50°C и стерильно вводят 10,0 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 2,5 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,8 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 1,0 мас.% и объем доводят до 1,0 дм³ стерильной водой. Концентрация ферментируемых сахаров 116,0 г/дм³.

Данные представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 3

Приготовление посевного материала нового штамма, питательной среды для выращивания посевного мицелия и выращивание посевного мицелия проводят аналогично примеру 1. Приготовление суспензии ферментных препаратов аналогично примеру 2.

Основным сырьем для приготовления ферментационной среды является кукурузный крахмал.

Для ферментационной среды готовят суспензию из 160 г кукурузного крахмала, получая 28,5 мас.% суспензию (в расчете на сухое вещество), которую нагревают при интенсивном перемешивании до 60°C и вводят ферментный препарат «Амилосубтилин» в количестве 6,9 см³ с содержанием α-амилазы 0,138 г, что соответствует дозировке препарата 0,001 г на 1 г сырья. При постоянном перемешивании доводят температуру до 82°C и выдерживают при этой температуре 90 мин, получая гидролизат с ДЕ=25%, обеспечивающим содержание глюкозы 3,3%. Для прекращения действия ферментного препарата полученный гидролизат нагревают до 95°C, затем охлаждают до 20°C и стерильно разбавляют водой до концентрации ферментируемых сахаров 140 г/дм³.

В полученный гидролизат крахмала для ферментации стерильно вводят раствор нитрата аммония в количестве 10,3 г/дм³ концентрации 10 мас.%, обеспечивающий массовую концентрацию 2,5 г/дм³, стерильный автолизат мицелия культуры Aspergillus niger в количестве, обеспечивающем соотношение углерода и азота 75:1, 2,5 см³ раствора сульфата магния гептагидрат концентрации 10 мас.%, обеспечивающего массовую концентрацию 0,25 г/дм³, 1,6 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%, обеспечивающего массовую концентрацию 0,16 г/дм³.

Ферментацию питательной среды осуществляют при температуре 32°C в течение 5 сут.

Данные представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 4

Приготовление посевного материала нового штамма, питательной среды для выращивания посевного мицелия и выращивание посевного мицелия проводят аналогично примеру 1. Приготовление суспензии ферментных препаратов аналогично примеру 2.

Приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 3, но готовят суспензию из пшеничного крахмала, получая гидролизат с ДЕ=30%.

Ферментацию питательной среды осуществляют при температуре 32°C в течение 5 сут.

Данные представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 5

Приготовление посевного материала нового штамма, питательной среды для выращивания посевного мицелия и выращивание посевного мицелия проводят аналогично примеру 1. Приготовление суспензии ферментных препаратов аналогично примеру 2.

Приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 3, но готовят суспензию из картофельного крахмала, получая гидролизат с ДЕ=18%.

Ферментацию питательной среды осуществляют при температуре 32°С в течение 5 сут.

Данные представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 6

Приготовление посевного материала нового штамма, питательной среды для выращивания посевного мицелия, выращивание посевного мицелия проводят аналогично примеру 1.

Приготовление суспензии ферментных препаратов и ферментацию проводят аналогично примеру 2.

Основным сырьем для приготовления ферментационной среды является помол зерна пшеницы.

Для ферментационной среды готовят суспензию из 200 г помола зерна пшеницы и 600 см³ водопроводной воды, получая 19 мас.%-ную суспензию помола зерна пшеницы (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 15:1. Вводят 0,6 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 1,5 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,48 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%.

Концентрация ферментируемых сахаров 120,0 г/дм³ (табл.2).

Данные, представленные в таблице 2, показывают, что новый штамм RCAM 02149, выращенный на сахарозо-минеральной среде, существенно превосходит известный штамм ВКПМ F-501 по интенсивности биосинтеза лимонной кислоты с единицы объема в сутки и выходу лимонной кислоты от затраченного сахара. Новый штамм позволяет использовать различные виды крахмалсодержащего сырья для производства лимонной кислоты, ферментируя питательные среды на основе гидролизатов муки из зерна ржи, гидролизатов помола зерна пшеницы, гидролизатов крахмала, и достигнуть интенсивности биосинтеза лимонной кислоты 18,4-24,8 г/(дм³·сут), конверсии сахаров в лимонную кислоту 84,7-99,3%, в то время как у штамма ВКПМ F-501 эти показатели на крахмалсодержащем сырье значительно ниже: интенсивность биосинтеза лимонной кислоты - 17,1 г/(дм³·сут), конверсия сахаров в лимонную кислоту - 77,2%.

Таким образом, селекционированный штамм RCAM 02149 является достаточно универсальным активным кислотообразователем и предлагается для ферментации сахарозо-минеральных сред и сред, полученных в результате гидролиза крахмалсодержащего сырья, обеспечивая высокие показатели процесса.

Таблица 1 Сравнение культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков нового штамма Aspergillus niger RCAM 02149 с Aspergillus niger ВКПМ F-501 Признаки Показатели Наименование штамма Отличия:
- отсутствуют или незначительные
+ имеются RCAM 02149 ВКПМ F-501 1 2 3 4 5 1. Культуральные признаки на сусло-агаровой среде 1.1 Окраска конидий светло-бежевая светло-бежевая - 1.2 Диаметр колонии, мкм 81 94 + 1.3 Вид обратной стороны колонии гладкая, белого цвета радиально складчатая, белого цвета + 2. Морфологические признаки на сусло-агаровой среде 2.1 Диаметр конидиальных головок, мкм 40-125 100-140 + 2.2 Длина стеригм первого порядка, мкм 12,0 11,6 - 2.3 Длина стеригм второго порядка 7,3 4,5 + 2.4 Диаметр конидий, мкм 4,5 3,4 +

Продолжение таблицы 1 2. Морфологические признаки на сусло-агаровой среде 2.5 Длина конидиеносца, мкм 510-1410 270-1000 + 2.6 Диаметр конидиеносца, мкм 11-22 9-18 - 3. Физиолого-биохимические признаки 3.1 Температурный диапазон роста, 28-36 30-34 + 3.2 Оптимум температуры, °C 32 32 - 3.3 Оптимум pH 1,7-7,0 6,8-7,2 + 3.4 Отношение к источникам азота Усваивает азот органических соединений (пептон, белок, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мицелиальную массу, мочевину), ассимилирует азот минеральных соединений - соли аммония, нитраты Усваивает азот органических соединений (белок, пептон, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину), ассимилирует соли аммония, нитраты -

Продолжение таблицы 1 3. Физиолого-биохимические признаки 3.5 Отношение к источникам углерода Хорошо усваивает и растет на мелассе, сахарозе, глюкозе, гидролизатах крахмала, гидролизатах муки из зерна ржи, риса и гидролизатах зерновых помолов ржи, пшеницы, риса, содержащих глюкозу, мальтозу, декстрины Усваивает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, в меньшей степени манит, галактозу, сорбит + 3.6 Конверсия сахаров в лимонную кислоту, % 84,7-99,3 82,2 + 3.7 Интенсивность биосинтеза, г/(дм³·сут) 18,4-24,8 18,2 +

Таблица 2 Показатели процесса ферментации № п/п Наименование сырья Количество затраченного сахара на колбу, г Длительность ферментации, сут Наименование штамма Количество лимонной кислоты, г/колба Содержание лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот, % Конверсия сахаров в лимонную кислоту, % Интенсивность биосинтеза лимонной кислоты, г/(дм³·сут) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Сахарозо-минеральная среда 8,0 6,0 RCAM 02149 7,24 96,0 90,5 20,1 ВКПМ F-501 6,56 94,5 82,2 18,2 2 Гидролизат ржаной муки ДЕ=32% 5,8 4,5 RCAM 02149 4,97 93,4 85,7 18,4 ВКПМ F-501 4,62 92,0 79,6 17,1 3 Гидролизат кукурузного крахмала ДЕ=25% 7,5 5,0 RCAM 02149 7,45 98,0 99,3 24,8 ВКПМ F-501 6,98 96,1 93,1 23,3

Продолжение таблицы 2                   4 Гидролизат картофельного крахмала ДЕ=18% 7,5 5,0 RCAM 02149 6,98 95,2 93,1 23,3 ВКПМ F-501 6,44 92,7 85,9 21,5 5 Гидролизат пшеничного крахмала ДЕ=30% 7,5 5,0 RCAM 02149 7,15 96,2 95,3 23,8 ВКПМ F-501 6,30 94,8 84,0 21,0 6 Гидролизат помола пшеницы ДЕ=35% 6,0 4,5 RCAM 02149 5,08 92,9 84,7 18,8 ВКПМ F-501 4,63 88,7 77,2 17,1

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus niger В-6 является продуцентом лимонной кислоты. Штамм Aspergillus niger депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM02149 и может быть использован при производстве лимонной кислоты. Изобретение позволяет повысить выход лимонной кислоты. 2 табл., 6 пр.

Штамм гриба Aspergillus niger RCAM02149 - продуцент лимонной кислоты.