Способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз Советский патент 1980 года по МПК C08B15/00 C07G7/02 

Изобретение относится к области биотехнсяогии, в частности к способам получения сорбентов для аффинно хроматографии протеаз серинового типа и может быть использовано в ферментной г,-эомьашленности для получения препаратов высокоочищенных протеаз серинового типа, которые находят применение в различных обла тях. Аффинная хроматография является наиболее эффективным методом, позво ляющим выделить многие биологически активные вещества с высокой степень очистки. В литературе описан ряд способов получения сорбентов для аффинной хроматографии протеаз серинового типа. Известен, например, способ получения таких сорбентов, основанный на взаимодействии хлорсульфонированного сополимера стирола и дивинилбензола в качестве носителя с Н-(п-аминобензил)-Ь-тирозином 1 Основным недостатком этого способа является использование в качестве лиганда N-(п-аминобензил)-Ь-тирЬзин снижающее специфичность сорбента. Этот сорбент не позволяет получать протеапитические ферменты, в частности, серинового типа, в чистом виде. Известен также способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз путем -взаимодействия носителя полимерной структуры с аминокислотой L-лизином в присутствий активатора 2. Известный способ предусматривает использование в качестве носителя сефарозы, которую активируют бромцианом. Использование этого носителя резко ограничивает возможность использования получаемого сорбента для аффинной хроматографии в промышленных масштабах, поскольку сефароза является малоустойчивым полимером, что не позволяет использовать ее длительно и многократно. Кроме того, известный сорбент имеет небольшую емкость по отношению к сериновым протеазам. Цельк) описываемого способа является устранение недостатков известного способа, то есть расширение ассортимента биоспецифических сорбентов и улучшение их технологических характеристик, в частности повышение емкости по отношению к сериновым протеазам и обеспечение возможности длительного и многократного использования. Описывают способ получения сорбен тов для аффинной хроматографии сериновых протеаз с улучшенными технологическими характеристиками путем взаимодействия носителя полимерной структуры с аминокислотой L-лизином в присутствии активатора, причем в качестве носителя используют целлюлозу или ее карбоксиметилпроизводное, а целевые продукты выделяют прогФгвкой буферными растворами, содержащими р, 5 М NaCI, этанолом и высушиванием. В качестве носителя для иммоби-. лизации лиганда, L-лизина, используют целлюлозу, которую активируют бромцианом,или карбоксиметилцеллюлоз которую активируют дициклогексил карбодиимидом. L-лизин связывают с носителем. Если в качестве носителя используют активированную BrCN цел люэозу, то связывание L-лизина производят после отмывания носителя от избытка активатора. Если в качестве носителя используют карбокси метилцеллюлозу, то ее связывание с L-лизином осуществляют в присутствии активатора, в качестве которого используют дициклогексилкарбодиимид. .. Пример 1. Способ получения L-:лизинцeллюлoзы в присутствии бромциана. 3 г целлюлозы суспендируют в 100 воды, охлаждают льдом, смешивают со 100 мл 2М раствора карбоната натрия При интенсивном перемешивании в смесь вводят 3 г бромциана, растворенные в 1,5 мл ацетонитрила. Через 2 мин активированную целлюлозу фильтруют на воронке Бюхнера и посл довательно промывают охлажденным 0, раствором-NaHCO, рН 9,5 (500 мл), водой (500 мл), О ,2- н .раствором NaHCO, рН 9,5 (500 мл). 3 г L-лизина растворяют в 100 мл 0,2М раствора NaHCO.pH 9,5, и затем в этом же растворе суспендиру отфильтрованную активированную целлюлозу. Смесь оставляют на 18 ч при на магнитной мешалке. Модифицированный сорбент фильтруют- и промывают последовательно 0,1М, раствором ацетата натрия, рН 4,0 (500 мл), 2н.раствором мочевины (500 мл) , 0,1М раствором NaHCO, (500 мл), рН 10,0 (все перечисленные растворы должны содержать О,5М NaCI7, этанолом (200 мл) и высуши- вают на воздухе. Пример 2. Способ получения -лизинкарбоксиметилцеллюлозы в рисутсвии дициклогексилкарбодиимида ДЦКЛ) . В водный раствор гидрохлорида -лизина (10 г в 150 мл воды) при Н 4.(38 вводят 20 г карбоксиметилеллюлозы и при постоянном перемеивании приливают по каплям в течеие 20 мин спиртовый раствор ДЦКД 10 г ДЦКД в 20 мл этанола). Смесь ставляют при ЮС на 20 ч. Полученный сорбент последовательо промывают на коробке Бюхнера танолом, смесью этанол:вода - 1:1, ,001 HoHCI, водой, 0,1М NaHCOj, ,05М фосфатным буфером, рН 7,4(все перечисленные растворы должны одержать 0,5 М NaCI) высушивают а воздухе. Хранят L-лизинцеллюлозу и карбоксилметилцеллюлозу в высушенном состоянии или в виде суспензии в 0,05М фосфатном буфере при 4°С. Специфическая емкость L-лизинцеллюлозы и L-лизинкарбоксиметилцеллюлозы определена на аминокислотном анализаторе ААА-881 (ЧССР) после кислотного гидролиза сорбента. Данные сорбенты могут быть длительно и многократно использованы без снижения их специфической емкости. В табл.1 представлены данные по определению специфической емкости при 5-кратном использовании сорбентов. Таблица 1 Специфическая емкость L-лизинеллюлозы и L-лизинкарбоксиметилцел- люлозч. Данные иследования высокоочищенного плазминогена, выделенного на сорбентах, получаемых по описываемому способу, и на известном сорбенте L-лизинсефарозе приведены в табл.2.

Выход и степень очистки плаэминогена, вьщеленного на L-лизинцеллюлоэе, L-лизинкарбокгтиметилцеллкшозе и L-лизинсефарозе методом аффинной хроматографии

Таблица 2

Формула изобретения 1„ Способ получения сорбентов для аффинной хроматографии сериновых протеаз путем взаимодействия носителя полимерной структуры с аминокислотой L-лизином в присутствии активатора, отличающийся тем, что, с целью расширения ассортимента сорбентов и улучшения их технологических характеристик, в качестве носителя применяют целлюлозу или ее карбоксиметилпроизводное, а целевые продукты выделяют промывкой буферными растворами, содержащими 0,5М NaCI, этанолом и высушиванием,

50

30

90

216

20 63 1380 69 282 100 мл 31 ке/м 1260 12,6 ке/мл 190

карбоксиметилцеллюлозы в качестве носителя в качестве активатора применяют дициклогексилкарбодиимид.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2.D.G.Peutsch, E.T.Mertr. Plasminogen.-purification from numdn plasma by affinity chromatography, Science, 170, 1095-1096, 1970 (npoтотИп),