Способ получения ингибитора фосфолипазы с Советский патент 1980 года по МПК C12D13/00 

54) СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА. ФОСФОЛИПАЗЫ С CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

1

Изобретение относится к микробиологической промьплленности и может быть использовано в медицине.

Известен способ получения ингиби- с тора фосфолипазы С Clostridlum perfrirr gens из крови иммунизированных лошацей {1 .

Однако известный способ не обеспечивает высокой детоксицирующей .актив-. ности целевого продукта, так как антитоксические сыворотки для профилактики не используют, а эффективность серотерапии недостаточна.

Целью изобретения является повышение детоксицирующей активности 5 целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что штамм Streptoverticillium mycohep- tinicmn-255 выращивают на питатель- 20 ной среде, содержащей источники углерода, азота и минимальные соли, нативный раствор освобождают от примесей последовательным пропусканием через анионит ФАФ в хлоридной форме, 25 подкислениём до рН 5,3-5,5, прогре-. ванием при 50-55°С, обработкой сульфатом аммония до 55-60% насыщения, отстаиванием при 4-10°С в течение 18-20 ч, центрифугированием ультра- изо

диафильтрацией супернатанта, лиофильно высушивают и очищают от протеаз.

Способ осуществляют следующим образом.

Производят обработку нативного раствора Stv. mycoheptinicum-255 анионитом ФАФ (коэффициент набухания 4,2) в хлоридной форме в динамических условиях с целью частичного освобождения от балластных белков, пигмента и антибиотика микогептина. После этого подкисляют полученный раствор до ,5-5,3, прогревают в течение 30 мин при 50 с целью частичной кислотной и тепловой денатурации ряда балластных белков, в том числе протеаз.

Высаливают ряд балластных белков, в том числе протеаз сульфатом аммр ;ния (55-60% насыщения). Осадок формируется при 4-10с в течение 18-20 ч, затем его центрифугируют.

Осуществляют ультра- и диафильтрацию супернатента через ацетилцеллюлозную мембрану УАМ5150 Л с диаметром пор не более 150 А и удельной скоростью фильтрации пэ воде не более 2-10 мл/мин-см атм - полностью проницаемую для минеральных солей. (« частности, сульфата аммония), в значительной степени проницаемую для пигмента и задерживающую ингибитор на 90-80%. Лиофильно высушива ют деминерализованный концентрат, п яученный в результате ультра- и диа фильтрации. Таким образом, получгиот препарат ингибитора полностью очищенный от антибиотика микогептина, минеральных солей, ряда балластных белков и пигмента. Препарат содержит ингибитор Фосфолипазы С с примесью пр теаэы. С целью полной очистки ингибитора далее проводят либо гель-хроматографию препарата на сефадексе fine.,используя в качестве элюе та 0,0005 М фосфатный буфер {рНи7,0 либо )Изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности. Полученные в результате гельхроматографии фракции, характеризующиеся ингибирующим действием на фосфояипазу с, не содержащие п{зотеа зу, ЛИОФИЛЬНО высушивают. Аналогичные фракции, полученные в результате изоэлектрического Фоку сирования, перед лиофилизацией осво бождают от амфолина и сахарозы ультрафильтрацией Через ацетилцеллюло кую мембрану УАМ.150 и с диаметром пор 120 А. Полученный высокоочищенный ингибитор Фосфолипазы С при содержании 0,65 мг белка/мл характеризуется 60% ингибиции 0., 16 мг белка/мл - 2 ингибиции. Выделенный ингибитор Фосфолипазы С является- веществом белковой природы, гомогенный при диск-электр форезе в полиакриламидном геле при рН«8,3. Молекулярная масса ингибито определенная методом гель-хроматографии, составляет 3500-4001). При изозлектрическом фокусировании в градиенте плотности ингибитор разделяется на 2 изоформы с изоэлектри ческими точками 8,50 и 8,15. Ультрафиолетовый спектр ингибито ра является характерным для белков, максимум поглощения 278-280. Таким образом, выделенный ингиби тор Фосфолипазы С является основным полипептидом с,мол. массой 3500-400 Активность ингибитора фосфолипазы определяют по угнетанию специфического гидролиза фосфатидилхолина (лецитина) в лецитевителлиие методом диффузии в агар и серийном разведе|НИЙ. в первом случае учитывают величину зоны приципитации (6 мм), во вт ром титр. Обсчет эффекта ведут по сравнению результатовв контроле и опыте по формуле - ЮО, где А- эффект в контроле, В - эффект в опы те. Показано, что выделенные образцы обладают ингибиторной активностью в отношении Фосфолипазы С-CI perfringens типа А.ЗД5оСоставляла (по белку) 0,55 мг/мл, ад,оо- 1,1-1,15мг/мл. Связывание в выбранной системе (вода, изотонический раствор, хлорида натрия, 0,005 М фосфатный буфер) было необратимым. Белки сыворотки крови на активность ингибитора не влияли. Токсичность ЛИОФИЛЬНО высушенного ингибитора, не содержащего биологически активные примеси, излучали в опытах на салицах белых мышей породы SHR весом 18 г. Препарат вводили однократно, внутрибрюшинно и внутривенно (в хвостовую вену мышей) в изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными вели в течение 10 сут. Учитывали выживаемость, активность и вес животных. Использованы следующие дозы ингибитора по белку 1,1 мг/ |чышь и 0,55 мг/мышь, что соответствовало 100 и 50%-ным ингибиторным концентрациям. За срок наблюдения группы животных, получавших однократно ингибитор внутривенно и внутрибрюшинно, были живы, активны и не теряли в весе (вес контрольной группы через 10 сут. I9tl,l г, опытных соответственно 18,8+0,8 и 19,3±1,0 г. При контрольном вскрытии опытных мышей, забитых на 11 сут. после введения ингибитора, макроскопических изменений не выявлено. Пример. В качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл соево-кукурузной среды, вносят 5 мл посевной культуры, выращенной в речение 2 сут. при на среде, г/л: соевая мука 20, глюкоза 20, хлористый натрий 1. Культивирование проводят в течение 5 сут. По окончании процесса ферментации культуральную жидкость сливают, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Получают 300 мл нативного раствора, в котором содержался ингибитор. Нативный раствор пропускают со скоростью 90-100 мл/ЧСМ через колонку, загруженную б г анионита ФАФ в хлоридной форме с коэффициентом набухания 4,2. Анионнт в значительной степени сорбирует антибиотик .микогептин, пигменты, частично балластные белки в том числе протеазу. Полученный раствор подкисляют до рН « 5,5, прогревают 30 мин при , быстро охлаждают до комнатной температуры. Затем проводят высаливание балластных белков, в том числе протеаз сульфатом аммония до 55% насыщения (351 г на 1 л). После формирования сйзадка на холоду в течение 18 ч осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Полученный супернатант помещают в ультрафильтрационный аппарат периодического действия с пбремешением. В качестве ультрафильтра используют селективно подобранную мембрану УАМ-150 М, характеризующуюся диаметром пор не выше 150 А,удельной скоростью фильтрации не выше 2,0-КИмл/минх «см-атм. Мембрана полностью проницаема для минеральных солей, в значительной степени для пигмента и задерживает ингибитор на 80-90%. Концентрирование проводят при давлении 2,5 3,0 атм. Затем проводят в этом же аппарате 3 диафильтрации при давлении 2,5-3,0 ати до полного обессоливания с последующим концентрированием. Концентрат лиофильно высушивают, затем растворяют в 2 мл фосфатного буфера и наносят на колонну, заполненную сефадексом G-50fine (1,0 X 60 см) уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рНа7,0). Элюцию проводят этим же буфером со скоростью 12 мл/ч. Фракции, характеризующиеся ингибирующим действием на фосфолипазу С, не содержащие протеазу и другие балластные вещества, лиофильно высушивают, из 300 мл нативного раствора выделяется 29 мг высокоочищенного ингибитора.

П р и М е р 2. 300 мл нативного раствора получают и обрабатывают также, как описано в примере 1 (обработка ФАФ, подкисление, прогрев, высаливание, ультра- и диафльтрация супернатанта, лиофильное -высушивание), Далее проводят изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности лиофильно высушенного препарата. Фракции, обладающие ингибирующим действием на фосфалипазу С, не содержащие протеазу, освобождают-от амфолинов и сахарозы диафильтрацией через ацетилцеллозную мембрану УАМ-150 М и лиофильно высушивают. Из 300 мл нативного раствора выделяется 40 мг высокоочищенного ингибитора.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую детоксицирующук активность целевого продукта, что позволит снизить количество случаев тяжельис ос0ложнений при травмах и ранениях.

Формула изобретения

Способ получения ингибитора фост

5 фолипазы С ciostridlum perfringens, отличающийся тем, что, с целью повышения детоксицирукяцей активности целевого продукта, штамм Streptovertic IIium mycoheptlnicum0255 выр.ащивают на питательной , содержащей исто.чники углерода, азота и минеральные; соли, {дативный раствор 1освобождают от примесей последовательным :прспусканмем через анионит ФАФ в хлоридной формо, пол5кислеиизм дэ рН 5,3-5,5, прогреванием при 50-55°С, обработкой сульфатом АММОНИЯ до 55-60 % насыщеиия, отст иаанием при 4-10®С в течение 18-20 ч, центрифугированием

0 ультра- и диафильтрацией супернатанта, затем лиофильно высушивают и очищают от протеаз.

Исто 1ники информации, принятые во внимание при экспертизе

5

1. Справочник по применению бактерийшлх и вирусных препаратов. М., Медицина, 1975, с. 95-96.