Способ получения ингибитора фосфолипазы с Советский патент 1982 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ФОСФОЛИПАЗЫ С

Изобретение относится к медиикне, а именЯ к способам получения ингибиторов ферментов. Известен способ получения ингибитора фосфолкпазы С из нативного раствора продуцента путем депигментации на анионите ФАФ с после дующим прогреванием при 50-55 С, отделением образовавшегося осадка и очисткой супернатанта 1 . Однако известный способ технологически сложен и ие поддается маститабированию. Цель изобретения - упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения ингибитора фосфолипазы С из натнвного раствора продуцен та путем депигментации на анионите ФАФ с последующим прогреванием при 50-55°С, отделением образовавшегося осадка и очисткой супернатанта и лифилизацией целевого продукта депигмснтирояанный раствор перед прогреванием подщелачивают до рН 9,2-9,7, последовательно обрабатывают растворами натриевой соли карбоксимстилцеллюлозы в концентрации 0,,07% и алюмокалиевых квасцав до установления рН 4,5-4,9 и затем прогревают в течение 4,5-5 мин. При зтом очистку супернатанга проводят с помощью диализа против 0,001 М фосфатного буфера при рН 5,2-5,7 или соч ганием диализа, ультра- и диафильтрации 0,001 М фосфатным буфером через мембрану У AM-100 М. При этом в качестве продуцента используют штамм streptomyces saraceticus yar. cerasus. Способ осуществляют следующим образом, Нативный раствор депигментируют, сорбируя пигменты иа анионите ФАФ в хлоридной форме с коэффи;;иентом набухания 3,8. Затем депигментированный иативный раствор подщелжчипают до рН - 9,2 - 9,7, обрабатывают при пер)емещивании натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы Na КМЦ (из расчета 60-70 мг на 100 мл раствора), затем добавляют при перемещивании раствор алюмочсалиевых кварцов до рН - 4,5-4,9 и прогревают 5 мин при 50°С, после чего супернатант отделяют центриф тиронанием и очищают от низкомолекулярных примесей диализом протиц 0,001 М фосфатного буфера при рН - 5,2-5,7 или сочетаннем диалича и ультра-и диафильтраций через ацетилцеяпюлозную мембрану УАМ - 100 М с диаметром пор 100-120 А при давлении 2,5 атм, десятикратном концентрировании при использовании фосфатного буфера (0,001 М рН 5,4) и диализованный супернатант или концентрат лиофильно высушивают известными способами.

Полученные препараты ингибитора не токсичны. Внутрибрюшинное введение препарата в дозах 50-100 мг/мышь (6,5 - 11 мг/мышь ПО белку) гибели белых мышей весом 18 20 г не вызывало.

Пример 1. 500 мл нативного раствора пропускают через колонку, загруженную 15,0 г анионита ФАФ в хлорндной форме с козффициентом набухания 3,8. Депигментнрованный нативный раствор подщелачивают до рН - 9,5, добавляют 6 мл 59 -ного раствора Na КМЦ (обшая концентрация Na КМЦ в обрабатываемом нативном растворе 0,06%). Через 5 мин перемеишвания добавляют 6%-ный расвтор алюмо-калиевых квасцов до рН 4,8. Вновь перемешивают 5 мин, а затем помещают на 5 мин в водяную баню при 50°С. Суспернатаит отделяют центрифугированием, м затем диализуют в течение 1 сут против 0,001 М фосфатного буфера (рН - 5,4). Диализованный супернаташ лиофаглно высушивают. Из 500 мл нативною раствора получают 200 мг очищенного препарата ингибитора фосфолипазы С, не содержащего балластных белков и характеризующегося 40-50%-ной ингибшшей при коицентращш 20 мг препарата/мл.

Пример 2. 500 мл нативного раствор обрабатывают так же, как в, примере 1, затем частично диализованный в течение 15 ч супернвтант концентрируют и обессоливают ультраи диафштьтрацией ацетилцеллюлозиую мембрану УАМ-150 М с радиусом пор 100-120 К. Из 500 мл нативного раствора при проведении одной диафильтраций с десятикратным разбавлением получают 50 мг препарата, характеризующегося 60-40% ной ингибицией при концентрации 10 мг препарата/мл и 30 40%-ной ингибицией при концентрагши 5 мг препарата/мл

Предлагаемый способ позволяет получить новый нетоксичный и стабильный ингибетор фосфолипазы С при сокращении числа технологических стадий и дешевизне используемого сырья.

Формула изобретения

тем, что, с целью упрощения способа, депигментированный раствор перед прогреванием подщелачивают до рН 9,2-9,7, последовательно обрабатывают растворами натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в концентрации 0,06- 0,07% и алюмокалиевых квасцой до установления рН 4,5-4,9 и затем прогревают в течение 4,5 - 5 мин.

с помощью диализа против 0,001 М фосфатного буфера при рН 5,2-5,7 или сочетанием диализа, ультра- и диафильтраций 0,001 М фосфатным буфером через мембрану УАМ - 100 М.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 734260 кл. С 12 D 13/00, 1978.