Способ получения фосфолипазы @ Советский патент 1984 года по МПК C12N9/16 

О

«аи Ф Г . 1Г Изобретение относится к микробио логической промьппленности, точнее к способам получения и очистки ферментных препаратов, и может Оыть использовано в технологии производ-т ства высокоочищенных ферментов. Известен способ очистки фосфояипазы D из Streptomyces hachijoensis включающий хроматографирование фильт рата культуральной жидкости на ДЭАЭцеллюлозе, лиофилизацию, гельфильтра цию через сефадекс Г-50, лиофилизацию и препаративное изоэлектрофокусирование. Выход фосфолипазы D составляет 53,3% от активности филь paта культуральной жидкости, удельная активность 630 ед/мг белка (за . единицу активности фосфолипазы J) принимают количество фермента, отщепляющее 1 иМэтанЬЛамина за 1 мин при 37°CJ р . Недостатками этого способа являются многостадийность и применение препаративного изоэлектрофокусирования на заключительной стадии очистки. Препаративное изоэлектрофокусирование является сложным :методом, требующим дорогостоящей . импортной аппаратупы, а пс следующая отмьшка препарата фермента от амфолинов ведет к снижению ферментативной активности и препятствует его применению для получения больших количеств высокоочищенной фосфолипазы D .. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения фосфолипазы D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus, включающий . высаливание бесклеточной культуральной жидкости сернокислым аммонием до 80%-ного насыщения с последующим диализом против 20-ти кратного объема 10 мМ трис-ДС1 буфера рН 8,0; содержащего 1М NaCl, в течение 18 ч при 4с и хроматографию на нониламинооксипропилсефарозе. Выход фермента 54% от общей активности фосфолипазы D в культуральной жидкости, удельная активность препарата 1700 ед/мг белка(за единицу активнос ти фосфолипазы D прини1 ают количество фермента, которое вьщеляет 1 JU М титруемьпс щелочью кислот за 1 мин при 37 с1 Сорбционная емкость нониламинооксипропилсеФарозы 300 ед. фосфолипазной активности на 1 г сорбента 2 . Недостатками известного способа являются невысокий выход и удельная активность целевого продукта, а также высокая стоимость полученной фосфолипазы D , так как для выделения фермента необходимо синтезировать специальный сорбент. Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевление способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фосфолипазы D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus ,. включающему диализ и последуюп ую хроматографию, хроматографию проводят на силохроме С-80, содержащем силанольные группы, осуществляя элюцию целевого продукта 8-12 мМ трис-НС1. буфером с рН 7,9-8,1, содержащим 1,4-1,6 М хлористый натрий. Сущность способа заключается в том, что хроматографию проводят на колонке с силохромом С-80, содержащим силанольные группы и характеризующимся удельной поверхностью JO90 , диаметром пор 400-500 А, объемом ,2-1,4 , размером зерен 80-160 мкм, неправильной формой зерен. При хроматографии диализата культуральной жидкости на этом сорбенте сорбированная фосфолипаза элюируется 8-12 мМ трис-НС1 буфером, содержащим 1 ,4-1 ,6 М НаСГ,1 при рН 7,9-8,1.. Пример. Способ очистки фосфолипазы Р из культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus в оптимальных условиях. Получение бесклеточной культуральной жидкости, содержащей фосфолиnasyD . Продуцент фосфолипазы D.Streptomyces cinnamomeus шт, 11 О2с культивируют на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: соевая мука 30; фруктоза 1; КНуР0 2; 3, при рН 7,2 в течение 48 ч при и скорости вращения качалки 2,5 с. Клетки микроорганизмов отделяют центрифугированием при 12000 X .g и температуре 2 С в течение 30 мин. Диализ. Бесклеточную культуральную идкость в объеме 34 мл дпализируют против 10 мМ трис-ИС буфера р11 8,0 в течение 18 ч при . Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 12000 X g и 2°jC в течение 30 мин. Активность диализата культу ральной жидкости 32,7 ед/мл, белка 0,23 мг/мл, удельная активность 142,2 ед/мг белка(j KTHBHOCTb опреде ляют по методу прототипа. Хроматография диализата культу ральной жидкости на силохроме С-80. Хроматографию проводят на стеклянно колонке размером 0,5«5 см, содержащей 0,33 г силохрома С-80, уравновешенного 10 мМ трис-НС1 буфером рН 8,0. Скорость протекания во врем сорбции и промьшки 0,2 мл/мин. 34 м диализата культуральной жидкости, содержащего-7,84 мг белка и 1112 ед активности фосфолипазы D , наносят на колонку. Несорбированные белки отмывают 50 мл исходного буфера, сорбированную фосфолипазу Б элюиру ют 10 мМ трис-НС буфером рН 8,0, содержащим 1,5 М NaCl со скоростью протекания 2,5 мл/мин. Выход фосфол пазы D 90,6%, удельная активность препарата 2664 ед/мг белка. П р;и м е р 2. Получение бесклеточной жидкости и диализ проводят по примеру 1. Для сорбции и элюции Используют буфер с молярностью 8 ил 12 мМ. Выход и удельная активность фосфолипазы при замене 10 мМ буфера на 8 или 12 мМ практически не изменяется. Влияние рН буфера и молярности хлористого натрия на эффективность разделения фосфолипазы J) и примесных белков при хроматографии., ка силохроме С-80, приведены в таблице. Приведенные примеры показывают, что для достижения положительного эффекта необходимо использовать для элюции 8-12 мМ трис-НС буфер с рН 7/9-8,1, содержащий 1,4т1,6 М хлористый натрий . Снижение рН буфера приводит к дестабилизации фермента, а увеличение рН не позволяет осуществить сорбцию за счет приближе ия к изоэлектрической точке(8,44) . Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта в 1,7 раза, а удельную активность в 1,6 раз, по сравнению С известным способом. Следует также отметить, что сорбционная емкость силохрома С-80 в 7 раз вьше сор5ционной емкости нониламинооксипропилсефаррзы, используемой для очистки фосфог липазы 1} по известному способу. Кроме того, предлагаемый для очистки фосфолипазы и силохром С-80 является дешевым широкодоступным сорбентом, который можно успешно использовать в технологии очистки больших количеств фосфолипазы TD .

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces clnnampmeus, включающий диализ и последую14ую хроматографию, отличающийс я тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевления способа, хроматографию проводят на силохроме С-80, содержащем силанольные группы, осуществляя элюцию целевого продукта 8-12 мМ трис-НС1 буфером с рН 7,9-85,1 содержащим 1,4-1,6 М хлористый натрий. О)