Способ подготовки колоний бактерий для электронной микроскопии Советский патент 1980 года по МПК C12K1/00 

(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КОЛОНИЙ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

1

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в процессе проведения микробиологических, цитологических, цитохимических, иммунобиологических и других исследований .

Известны способы подготовки колоний бактерий для изучения их структурной организации с помощью электронно-ю го микроскопа, заключающиеся в нанесении на поверхность агара пленки коколлодия на амилацетате, посеве бактерий на эту пленку, инкубировании их в термостате, разрезании пластинки агара с пленкой и колониями бактерий на кусочки 8-10 мм, погружении в дистиллированную воду, осторожном удалении агара под углом 45°, подведении сеточки под пленку с бактерия- 20 ми и высушивании ее; в с№лвах колоний бактерий с агара раствором фиксатора (для максимального сохранения поверхностных структур), немедленном центрифугировании, постфикации осадка, 25 заключении объектов в расплавленный агар, нарезании мелких кусочков застывшего агара с биологическим материалом с последующим общепринятым заключением в эпоксидные смолы 1,2 . 30

Недостатками таких способов являются многоэтапность и использование физических факторов, вызывающих ряд артефактов, в результате чего происходят потери микроорганизмов в процессе фиксации и последующей обработки материала, нарушение пространственных, взаимосвязей бактерий в колонии, нарушение ориентации.самих колоний в сравнении с первоначальной, артефакты в структурной организации бактерий.

Известен также способ вырезания кусочков агара с колониями и последующей их фиксацией. Для этого выращивают бактерии на плотной питательной среде, вырезают кусочки агара с колониями и переносят их в растворфиксатора с последующей обработкой для электронной микроскопии 3.

Недостатками такого способа являются потеря биологического материала и нарушение исходной ориентации колоний. Ориентация нарушается во время переноса кусочков агара с колониями в фиксирующий раствор. Кроме того, агар во время полимеризации эпоксидных смол (цри температуре более .высокой, чем точка плавления агара) смешивается с этими смолами, что может служить одной из причин артефактов ультраструктуры бактерий.

Цель изобретения - исключение потери микроорганизмов в процессе подготовки препаратов и сохранение их исходной ориентации в колониях.

Это достигается тем, что перед помещением бактерий на покрывные стекла последние предварительно покрывают слоем яичного белка. Способ дает возможность сохранить пространственную ориентацию и структуру колоний, предотвращая их потери при последующей обработке, исключает действие травмирующих факторов (ускорение, высокая температура, расплавление агара при полимеризации и др.), вызывающих различные артефакты.

Способ осуществляется следующим образом.

На чистые покрывные стекла наносят максимально тонкий (не более 0,2 мм) слой яичного белка и дают ему подсохнуть при комнатной температуре в течение 2-3 мин. После этого белковой поверхностью стекла прикасаются к колониям, выросшим на агаре. При этом колонии бактерий легко прилипают к белковому слою. Сразу после этого пок1ялвное стекло с колониями опускают в раствор фиксатора (колониями вверх). Дальнейшая проводка осуществляе.тся по стандартной методике. При этом, благодаря наличию белкового слоя на покрывном стекле, колонии микроорганизмов не открепляются. Далее покрывное стекло со стороны погружают в эпоксидную смолу (плоская заливка). После полимеризации эпоксидной смолы с погруженными в нее колониями бактерий покрывное стекло также,благодаря наличию белкового слоя легко снимается с помощью жидкого азота (для чего погружают стекло в жидкий азот на 3-5 сек).

Предлагаемый способ испытывался в течение 4-х лет в лаборатории биофизики. Результаты испытаний сравнивались с результатами, полученными при снятии колоний на покровные стекла без предварительного нанесения белкового слоя, и с результатами способа, принятого за прототип. Время проводки материала до заключения в эпоксидные смолы варьировало от 6 до 96 час без потери колоний, что позволяет использовать -предлагаемый способ для подготовки к электронно-микроскопическому исследованию колоний бактерий разных видов, отличающихся проницаемостью клеточных стенок и требующих разной по длительности обработки для электронной микроскопии.

Предлагаемый способ обеспечивает 5 сохранение ориентации колоний, соответствующей их росту на плотной питательной среде, и позволяет на серийных параллельных срезах изучать как ультраструктуру, так и пространственные взаимосвязи бактерий на разной глубине бактериальных колоний.

Формула изобретения

Способ подготовки колоний бактерий для электронной микроскопии, включающий помещение бактерий на покрывное стекло и их фиксацию, отличаю щийс я тем, что, с целью исключения потери микроорганизмов в процессе подготовки препаратов и сохранения их исходной ориентации в колониях, перед помещением бактерий на покрыч 1ые стекла последние предварительно покривают слоем яичного белка..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.HiEEег J., Knaysi J., Boker R. Bact 3., 1948, т. 56, с. 569-576.

2.Высоцкий В. В. и др. ЖМЭИ, 1977, т. 8, с. 90-95.

3.Константинова Н. Д. и др. ЖМЭИ 1977, т. 4, № с. 50-53.