Способ приготовления препаратов молочных белково-жировых продуктов для изучения их микроструктуры Советский патент 1988 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к пицевой промьшшенности, а именно к электро но-микроскопическим исследованиям и может найти свое использование при приготовлении препаратов молочных белково-жировых продуктов для изучения их микроструктуры о

Целью изобретения является повышение качества препаратов.

В предлагаемом способе фиксацию препарата проводят раствором четы- рехокиси осмия, приготовленным на дистиллированной воде, с рН 6,0 - 6,4. Выбор четырехокиси осмия в качестве фиксирующей жидкости для молочных белково-жировых продуктов определяется тем, что использование водного раствора четырехокиси осмия с рН, близким к рН исследуемых продуктов, гарантирует сохранеьше суб- мицеллярного и мицеллярного состояния молочного белка, Четырехокись осмия действует не только как фиксатор, но и как контрастирующее вещество. Кроме того, фиксация четы- рехокисью осмия препятствует экстракции липидов в процессе последующей заливки.

Фиксация препаратов в течение менее 20 мин не дает статистически достоверных данных по тапощне оболочки жирового шарика, что видимо, связано с малой и неравномерной проникающей способностью четырехокиси осмия, фиксация в течение более 30 мин также не дает возможности получить качественные препараты, что вызвано растворением липидно-бе;ко- вых компонентов и прежде вceг оболочки жирового шарика при длительном контакте материала с четырехс 1а1сью осмия о

При фиксации препаратов исследуемых молочных белково-жировых продуктов в течение 20-30 мин получены статистически достоверные результаты по толщине оболочек жировых шариков.

Для уменьшения экстракции липидов можно использовать в качестве обезвоживающей жидкости этиловый спирт, Поэтому в предлагаемом изобретении предлагается промывку, обезвоживание и пропитку проводить с использованием этилового спирта.

Погружение исследуемого материала после фиксации в спирт слабой концентрации (менее 69%) сопровождается явлениями неравномерной мацерации,

что приводит к сморщиванию белковых компонентов и особенно субмицелляр- ного слоя оболочки жирового шарика,

в результате полученный разброс данных по толщине оболочки не поддается статистической обработке Погружение же объектов сразу в крепкий спирт (абсолютный с концентрацией

99,9-100%) приводит к разрыву оболочек жировых шариков и смещеьшю структурных элементов, что, в конечном итоге, не дает возможности получить статистически достоверные данные по размерам структурных элементов и правильное представление о микроструктуре, в частности, стерилизованных кремов с кофе и какао с,

Установлено что промывка объектов молочных белково-жировых продуктов в этиловом спирте с концентрацией 69-72%, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации (сначала 79 - 82, затем 95 - 97% и трижды в абсолютном спирте с концентрацией 99,9 - 100%) обеспечивают необходимое качество препаратов. Наличие следов воды мешает полимеризации блоков при последующей пропитке и заливке препаратов эпоксидной смолой. При одно- и двухразовой обработке препаратов абсолютным спиртом с концентрацией 99,9 - 100% иногда в по- лимеризованных блоках, готовых к

изготовлению срезов, обнаруживаются пузьфьки воздуха, что связано с заг- рязне1щем препарата водой. При трехразовой обработке абсолютным спиртом препаратов качество последних было

гарантированным и артефактов при просмотре в электронном микроскопе не наблюдали

Обезвоженные препараты подвергают пропитке в запивке эпоксидной смолой.

Препараты исследуемых молочных белково-жировых продуктов обрабатывают с применением центрифугирования объекта на всех этапах подготовки его. Цель пропитки - проникновение эпоксидной смолы в исследуемый материал. Для получения прочных блоков биологических объектов необходимо постепенно замещать обезвоживающую жидкость на эпоксидную смолу, поэтому

процесс пропитки препарата осуществляют с Постепенным замещением спирта эпоксидной смолой. Наличие менее вязкого спирта способствует более глубокому и полному проникновению

эпоксидной смолы в препарат а Применение центрифугирования после каждого этапа пропитки также облегчает проникновение эпоксидной смолы в препарат.

Экспериментально установлено, что трехэтапная пропитка препаратов смесью абсолютного спирта (с концентрацией 99,9 - 100%) и эпоксидной смо

лы (на первом этапе в соотношении 3:1, на втором и третьем - 1:1 и 1:3) дает возможность сохранить псе элементы ультрамикроструктуры продуктов и определить их размеры. При других соотношениях спирта и эпоксидной смолы наблюдаются разрывы оболочек жировых шариков, что ухудшает качество готовых препаратов.

Экспериментально установлено также, что для исследуемых молочных белково-жировых продуктов заливка в эпоксидной смоле в течение 15-18 ч обеспечивает хорошую прочность поли- меризованных блоков. При выдержке менее 15 ч встречаются мягкие блоки, а при полимеризации более 18ч- очень хрупкие, в обоих случаях получают некачественные срезы.

Для получения качественных препа- паратов образцы исследуемых молочных белково-жировых продук тов обрабатывают с применением центрифугирования объекта на всех этапах подготовки его. Скорость и продолжительность

после каждой обработки а течение 7 мин при 2500 об/мин. Предварительную пропитку проводят в смеси 100 - ного спирта и эпоксидной смолы арал- дит в пропорции 3:1, 1:1, 1:3 в течение часа при комнатной температуре с центрифугированием после каж- дои обработки в течение 15 мин при 5000 об/мин, В чистой смоле осадок оставляют на 15 ч, затем центрифугируют в течение 30 мин при 8000 об/мин и переносят осадок в желатиновые капсулы, наполненные заливочной смолой (аралдит М + аралдит НУ в равных количествах с добавлением 1,5% катализатора) и полимеризуют при А5°С в течение суток и при . 60 С 2 сутока Из полученных блоков с белково-жировой смесью изготавливают ультратонкие срезы, монтируют их на сетки, контрастируют 2%-ным раствором уксусно-кислого уранила в 70 -ном спирте в течение 10 мин и цитратом свинца - 15 мин. Срезы просматривают в электронном микроскопе.

Пример 2, Стерилизованные крем с кофе и крем с какао, сЬдержа- ние 45% молочного жира и 5% молочного белка, являются маслоподобными продуктами и имеют достаточно прочную структуру при температуре хранения О - 10 Со Поэтому Д.ПЯ фиксации вырезают кусочки кремов размером не бо

Изобретение относится к пищевой промлпленности, а именно к элект - ронно-микроскопическим исследованиям, и может найти использование при приготовлении препаратов молочных белко- во-жировых продуктов для изучения их микроструктуры. Целью изобретения является повышение качества препаратов. Для приготовления препаратов молочных белково-жировых продуктов для изучения от микроструктуры методом электронной микроскопии высокожирные смеси мороженого и стерилизованные молочные белково-жировые крем. фиксируют в водном 2%-ном растворе четырехокиси осмия, приготовленном на дистиллированной воде с рН 6,0 - 6,4 в течение 20-30 мин, центрифугируют в течение 5-10 мин прн 2000-- 2500 об/мин, прокывают в этиловом спирте с концентрацией 69-72%, обезвоживают сначала в этиловом спирте с концентрацией 79-82%, а затем с концентрацией 95-97% и трижды с концентрацией 99,9-100% с последующим центрифугированием после каждой промывки в течение 5-7 мин при 2000- 2500 об/мин. Затем проводят пропитку препарата смесью этилового спирта с концентрацией 99,9-100% и эпоксидной смолы в три этапа: на первом этапе в соотношении 151, на втором и третьем - в соотношении 1:1 - 1:3, центрифугируют после каждой пропитки 10-15 мин при 4000-5000 об/мин, осуществляют заливку в эпоксидной смоле в течение 15-18 мин с последующим центрифугированием в течение 20- 30 мин при 6000-8000 об/мин, полимеризацией, изготовлением срезов, размещением их на сетке, контрастированием и просмотром в электронном микроскопе. с S (Л 00 о ел о

центрифугирования при фиксации, обез- ос лее 1 1 мм, заливают 2%-ным раствовоживания, пропитке и заливке экспериментально подобраны в зависимости от химического состава исследуемых продуктов, т,е, от вязкостных характеристик

Пример 1, 2г молочных белково-жировых смесей с содержанием жира 10 - 15 и 3,5% молочного белка, используемых при производстве морожером четырехокиси осмия в дистилл ванной воде с рН 6,0 - 6,А и фик ют 30 мин при комнатной температ Фиксирующую жидкость декантируют 40 центрифугирования.

Остальные операции проводят а логично примеру 1: при промывке обезвоживании пробы центрифугирую

50

ного, фиксируют 2 МП 2%-ного раство- 45 осле каждой обработки 5 мин при ра четырехокиси осмия в дистиллированной воде с рН 6,0 - 6,4 в течение 20 мин, центрифугируют в центрифуге ЦУМ-1 при 2500 об/мин в течение 10 мин, для прекращения окисляющего действия фиксатора полученный осадок промывают 2 мл 70 -ного этилового спирта в течение 15 мин и центрифугируют 7 мин при 2500 об/мин, затем осуществляют обезвоживание осадка в спиртах возрастагацей крепости (по 2 мл) в течение 5 мин в каждом 70; 80; 96 и 3 раза в 100 -ном с последующим центрифугированием

55

2000 об/мин, при предварительной пропитке пробы центрифугируют 15 при 4000 об/мин, пропитку в чист смоле осуществляют в течение 18 с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин Предлагаемый способ позволяет получить качественные препараты молочных белково-жировых продукт изучить их ультрамикроструктуру, тановить размер структурных элем тов, в том числе жировых шариков толщину их оболочки, мицелл казе ТОЛ1ЦИНУ дисперсионных прослоек и

ром четырехокиси осмия в дистиллированной воде с рН 6,0 - 6,А и фиксируют 30 мин при комнатной температуре. Фиксирующую жидкость декантируют без центрифугирования.

Остальные операции проводят аналогично примеру 1: при промывке и обезвоживании пробы центрифугируют

осле каждой обработки 5 мин при

2000 об/мин, при предварительной пропитке пробы центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, пропитку в чистой смоле осуществляют в течение 18 ч с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин. Предлагаемый способ позволяет получить качественные препараты молочных белково-жировых продуктов, изучить их ультрамикроструктуру, установить размер структурных элементов, в том числе жировых шариков, толщину их оболочки, мицелл казеина, ТОЛ1ЦИНУ дисперсионных прослоек и

провести статистическую обработку полученных данных.

Применение водных растворов четы- рехокиси осмия, фиксация при комнатной температуре, исключение ацетона при промывке, обеввоживания, предварительной пропитке и центрифугирование после каждого этапа обработки материала дает возможность повысить качество исследуемых препаратов на 80-85%.

Использование предлагаемого способа позволяет также разработать научно обоснованную технологию стерилизованных кремов с кофе и какао со сроком хранения до трех лет и дает возможность усовершенствовать технологию приготовления мороженого.

Формула изобретения

Способ приготовления препаратов молочных белково-жировых продуктов для изучения их микроструктуры методом электронной микроскопии, отличающий ся тем, что, с целью по вьппения качества препаратов, в качестве исходного сырья используют высокожирные смеси мороженого и сте

3705606

рилиэованные молочные белково-жировые кремы, которые фиксируют в водном 2%-ном растворе четырехокиси осмия, приготовленном на дистиллированной поде, с рН 6,0 - 6,4 в течение 20 5

0

30 wH, центрифугируют в течение 5-10 мин при 2000-2500 об/мин, промывают в этиловом спирте с кон0 центрацией 69-72%, обезвоживают сна- в этиловом спирте с концентрацией 79-82%, а затем с концентрацией 95-97% и трижды - с концентрацией 99,9-100% с последующим центрифуги5 рованием после каждой промывки в течение 5-7 мин при 2000-2500 об/мин и проводят пропитку препарата смесью этилового спирта с концентрацией 99,9-100% и эпоксидной смолы в три

0 этапа: на нервом этапе в соотноше- НИИ 3:1, на втором и третьем в соотношении 1:1 и 1:3, центрифугируют после каждой пропитки 10-15 мин при ДО(Ю-5000 об/мин, осу1цествляь:1Т ливку в эпоксидной смоле в точение 15-18 мин с последующими центрифуги- рованием в течение 20-30 мин при 6000-8000 об/мин, полимеризацией, изготовлением срезов, размещением их на сетке, контрастированием и просмотром в электронном микроскопе.