Способ получения L-триптофана Советский патент 1983 года по МПК C12P13/22 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА

Изобретение относится к мнкробнологической промышленности, а именно к способу получения незаменимш аминокислоты L-трип тофана, применяющейся в фармацевтической промышленности и медщщне при приготовлении содержащих свободные аминокислоты смесей для парентералыюго питания, для обогащения белковых гидролизатов, используемых в тех же 1{елях, а также может бып применен в качестве добавки для балакхжрования состава кормов в живодноводстве. Из известных микробиологических способо получения L-триптофана наиболее экономически выгодным Является метод с применением микроорганизмов, способных продувдро вать триптофан на основе прямой фермента-, ции из пркктых источников углерода и азота без введения в среду предаиественников TfMoi фана, например индола или антранияовоя кИс лоты. При этом в качестве источникауглерода используют мелассу, гндрол или технический сахар, в качестве источника азота мочевину, соли аммония, а также необходимые ростовые добавки и минеральные соли. При получении кристаллического L-трнптофана высокой степени чистоты для медицинских целей значительно усложняется технология его выделения, что.приводит к. снижению конечного выхода продукта и увеличению расходов на его дополнительную очистку, в связи с чем эффективность любого способа получения триптофана оценивается с учетом стадии ферментации и стадии вьщеления кристаллического препарата. Известен способ получения триптофана П)ггем культивирования мутантных штаммов Согуnebacterium glutamicum на средах, не юдержащих предшественников этой аминокислоты для роста биотин, фшилаланин, тирозин, и резистентные, по крайней мере, к одному из аналогов триптофана и к одному из аналогов фенилаланина или тирозина 1. На среде с глюкозой и источником ростовых факторов (NZ-амин) уровень образова-. ния т{жптофана с культуральной жндкости

достигает 3,6 г/л за 4 сут культивирования. На среде с мелассой, кукурузным экстрактом и гидролизом соевого широта уровень образования триптофана достигается 3,4-16,8 г/л за 3-4 сут культивирования. Кристаллический триптофан в известном способе выделяют с помощью сильнокислотного катионита с выходом 50% из культуральной жидкости, со-, держащей глюкозу, как источник углерода. Для сред, содержащих мелассу, показатели, характеризующие процесс вьщеления триптофана, отсутствуют, чго связано очевидно с недостаточно эффективной очисткой триптофана, от других аминокислот, которые накапливаются в процессе ферментации или присутствуют в исходной ферментационной среде (например, если среда содержит мелассу).

Известен также способ выделения триптофана, нз культуральной жидкости, включающий селективную сорбцию триптофана на слабоосновном анионите с последующей его десорбцией водой или слабым раствором кислот и повторной сорбцией из этого раствора с целью концентрирования на сульфокатоните в Н -форме, и обеспечивающий выход кристаллического продукта до 70% в зависимости от требуемой чистоты конечного препарата 2.

Недостатками известных способов получения L-триптофана и способа его выделения из кyJpыypaльнoй жидкости микроорганизмов является:

потребность в нескольких ростовых факторах дая штаммов Cor, glutamicum, что вызывает необходимость введения в питательную среду источников этих факторов, в частности гидролизатов бепка;

большая длительность процесса культивирования микроорганизмов 72-96 ч;

низкий уровень накопления триптофана на стандартных исто1шиках углерода (глюкозе, сахаре), которые наиболее пригодны для эффективного выделения кристаллического триптофана, тогда как меласса и гидрол относясь к видам сырья с непостоянным составом компонентой, влияющих на рост микроорганизмов и биосинтез, не обеспечивают стабильных показателей на стадии ферментации, и снижают эффективность выделения кристаллического продукта высокой степени чистоты вследствие значительных примесей пигментов, минерапьных солей, аминокислот и о-ксикислот и т.д.;

относительно низкий выход (50%) кристаллического триптофана на стадии выделения из культуральной жидкости.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому

является способ получения L-триптофана путем глубинного культивирования штаммов Bacillus subtilis Ген-557/п или 2282 на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ростовые вещества и другие необходимые минеральные соли в условиях аэрации среды с последующим выделением L-триптофана одним из известных способов с помощью ионного обмена и кристаллизацией аминокислоты 3.

Недостатками известного способа являются невысокий уровень накопления триптофана на глюкозе и сахаре и больщая продолжи5 тельность ферментации (на среде с техническим сахаром уровень образования триптофана достигает 4,6 г/л, на среде с мелассой или гидролом 8,2-10,1 г/л за 72 ч культивирования) .

Целью изобретения является повышение выхода L-триптофана.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения L-триптофана, предусматривающему глубинное культивирование продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus subtilis в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ростовые вещества и необходимые минеральные соли, с последующим вьщелением целевого продукта из культуральной жидкости с помощью ионного обмена и кристаллизацией, из микроорганизмов вида Bacillus subtilis используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15, при этом в процессе культивирования в среду вводят концентрированную питательную добавку, содержащую источ 1ики углерода, неорганического азота и ростового вещества, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации растворенного кислорода в среде 10-40%.

Сущность способа заключается в культивировании нового щтамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика - 15 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, в условиях аэрации при подаче в процессе культивирования питательной смеси с последуюцдим вьщелением образовавшегося в культуральной. жидкости L-трипто. фана ионообменным способом. В качестве источника углерода используют технический сахар. На заключительной фазе роста через 12-30 ч после начала ферментации в ферментер дополнительно вводят питательную 5 добавку, содержащую источник углерода азота и ростовое вещество таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода не превышала 40%. Использование нового штамма ВНИИгенетика-15 в сочетании с введеиием подпитки в ходе ферментации позволяет увеличить скорость биосинтеза L-триптофана и повысит уровень его накопления в среде с использованием сахара (или сахарозы) в качестве источника углерода. Через 48 ч культивиров ния при 37° С уровень накопления L-триптофана в культуральной жидкости достигает 10,8 г/л. При вьщелении L-триптофана последовательно используют слабоосновной анионит конденсационного типа и сульфокатионит в Н-форме. Выход кристаллического L-триптофана составляет 65-75%. Новый штамм Вас. subtil is ВНИИгенетика-15 получен из известного штамма Вас. subtilis Ген-3557 путем с тупенчатой селекции, включающей обработку клеточной суспензии мутагенным фактором Ы-метил-М -нитрозо-М-гуанидином (концентрация 200 мг/м экспозиция 20 мин) и получение мутантов, резистентных к структурным аналогам аминокислот. На 1 ступени отбора обработанные мутагеном клетки штамма Ген-3557 были высеяны на минимальную среду, содержащую аналог гистидина 1-L-метилгистидин в концентрации 5 мг/мл. Среди выросших резистентных колоний бы отобран штамм 924, клетки которого после воздействия мутагеном были высеяны на среду, содержащую следующую смесь аналогов триптофана, фенилаланина, тирозина: 5-фтортриптофан (2 мг/мл), фенилаланигидро ксамат (0,5 мг/мл) и тирозингидроксамат (2,5 мг/мл). Из числа колоний, резистентных и указанной смеси аналогов аминокислот, был отобран штамм 22-13. Клетки штамма 22-13 бьши снова обработаны мутагеном и высеяны на среду, содержащую смесь тех же аналогов аминокислот, но в концентрации 2,5 мг/мл, 0,5 мг/мл, 2,5 мг/мл соответ ственно. Из числа колоний, резистентных к указанной смеси аналогов, был выделен штамм ВНИИгенетика-15. В табл. 1 приведены сравнительные данны об уровне накопления триптофана при ферме тации в колбах на среде с сахарозой у исхо ного штамма Ген-35 5 7 и нового штамма ВНИИгенетшса-15. В указанных условиях выход триптофана в конце ферментации у нового штамма ВНИИгенетика-15 превышает выход аминокислоты у исходного штамма на 45%. Высокий уровень накопления L-тpШlтoфaнa (9-11 г/л) у штамма ВНИИгенетика-15 может быть достигнут за 48 ч при культивировании в ферментере с введением питательной подпитки в ходе ферментации согласно предлагаемому способу. Штамм Bacillus subtlMs ВНИИгенетнка-1S хранится в Центральном музее промышленных микрооргага1змовинститута ВНИИгенетика, где он депонирован под номером ЦМПМ-В 306. Штамм Bacillus subtitis ВНИИгенетика15 имеет следующую культурально-Морфологическую характеристику. Грамположительная спорообразующая палочка. Колонии на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации прн 37°С достигают. 4-5 мм в диаметре, сплошные, круглые, с 1 изрезанным краем, поверхность гладкая, со слабой, радиальной по краю и концентрической в центре исчерченностью, цвет серовато-белый. Посев, штрихом на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации при 37° С дает умеренный рост, штрих-широкий с мелкозубчатым краем, запах - характерный, .консистенция - масл11нистая, вдет - серовато-белый. Рост на мясо-пептонном бульоне после 1 сут. инкуба- . ции при 37° С характеризуется умеренным помутнением среды без образования пленки, запах - характерный, осадок - скудный, тягучий при встряхивании. На агаризованной минеральной среде Спицайзена с глюкозой колонии посде 3-х суток инкубации, при 37° С достигают 1,5- 2,0 мм в диаметре, сплошные, круглые, с гладкой, блестящей поверхностью, грязнобелого цвета, структура однороднаяЛ Рост на жидкой минеральной среде Ълицайзена (24 ч инкубации при 37° С на кат чалке) характе{ 1зуется слабым струйчатым помутнением. среды. Рост штамма ВНИИгене.тика-15 на жидкой или агаризованной минимальной среде не стимулируется L-фенилаланином, в отличие от исходного штамма Ген-3557. Способ осуществляют следующим образом. Штамм Вас. subtilis ВНИИгенетика-15 выращивают в течение суток на агаризованной среде (МПА), пересевают в колбы со стерилыюй питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли, и выращивают в течение 18-24 ч на качалке, обеспечивающей достаточную аэрацию при температуре 28-ЭО°С в асептических условиях. Полученный посевной материал в количестве 1-10% передают в ферментер со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли. В качестве источника углерода используют сахарозу или содержащие ее субстраты, например технический сахар, в качестве источника азота - мо квину, в качестве источника ростовых веществ - кукурузный экстракт. 7 Ферментер снабжен датчиком концентрации растворенного кислорода, устройством для аэрации, перемешивания, поддержания температуры, отбора проб и пода:чи дополнительной питательной добавки в ходе ферментации Ферментацию осуществляют в течение 48 ч при температуре 35-40°С, рН 6-8, непрерыв ной аэрации и перемешивании. В начале процесса ферментации в связи с интенсивным ростом биомассы концентрация растворенного кислорода падает, а затем начинает возрастать. Через 12-30 ч после на4ajia ферментации при увеличении концентрации растворенного кислорода pOj выше 40% от насыщения воздухом при атмосферном да лении в ферментащюнную среду вводят концентрированную питательную добавку, содерж щую источник углерода, азота, ростовых веществ. Добавку вводят таким образом, что бы концентрация растворенного кислорода pOj не превышала 40%. За 48 ч ферментаци концентрация L-триггтофана в культуральной жидкости достигает 9-11 г/л. Полученную культуральную жидкость обрабатывают последователы№ известковым молоком и серной кислотой с целью отделения биомассы путем фильтрации или центрифугирования. Затем выделение кристаллического L-триптофана осу ществляют известным способом, с последовательной сорбцией L-триптофана на слабооснованном анионите конденсационного типа и сульфокатионите в Н-форме. Пример .1 (контрольный). Для при готовления посевною материала суточную культуру штамма Вас. subtil is BftHMi енетик 15, выращенную на агаризованной среде (МПА), пересевают в колбы емкостью 750 м содержание 40 мл стерильной посевной сред Посевная среда имеет следующий состав, %: Сахар технический Кукурузный экстракт (по техническому КН2 Р04 К2НРО4 ,0-7,2 Среду стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин. Посевной материал выращивают 18-20 ч на качалке (200-300 об/мцн) при 28-30°С. Для засева ферментационной среды посевной материал добавляется в количестве 5% Ферментационная среда имеет следующий состав, %. Сахар технический10,0 Кукурузный экстракт (по техническому весу)3,0 КН, Ю40,06 4 К2НР040,14 MgSO47HjO0,1 NaCI0,015 Мочевина0,5 ,0-7,2 Ферментационную среду без мочевины стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин. Мочевину в виде 25%-ного раствора стерилизуют отдельно при 0,5 атм в течение 30 мин и добавляют в основную среду перед посевом. Ферментацию проводят методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера (емкостью 250 мд с двумя отбойниками), содержащих 20 мл среды на качалках (400 об/мин) при t 37° С в течение 48 ч. Через 48 ч в культуральной жидкости накапливается 7,5 г/л L-триптофана. Пример 2. Штамм-продуцент, состав посевной и ферментационной сред тот же, что и в примере I. В отличие от способа ведения ферментации, описанного в примере 1, культивирование проводят с дробной подачей подпитки в зависимости от содержания растворенного кислорода в среде. Подпитка имеет следующий состав, %: Сахар технический50,0 Кукурузный экстракт20,0 Мочевина2,25 ,2-7,3 Подпитка стерилизуется при 0,8 атм в те«ние 30 мин. Мочевина стерилизуется отдельно в виде 25%-ного раствора при 0,5 атм в течение 30 мин. В ходе ферментации содержание растворенного кислорода (рОз) в среде снижается до нуля, затем возрастает. При повышении pOj до 40% подается подпитка в количестве, вызывающем снижение pOj. Подачу подпитки начинают через 19- 30 ч ферментации. Объем затраченной подпитки 44 мл. Динамика накопления триптофана в культуральной жидкости показана в табл. 2. Пример 3. Штамм-продуцент, состав посевной и ферментационной среды и подпитки тот же, что и в примере 2. Ферментацию ведут в ферментере объемом 30 л, коэффициент заполнения 0,5. Условия перемешивания и аэрации обеспечиваюг сульфитное число 3,5 г Оа/л ч. В ходе ферментации содержание растворенного кислорода (рОг) снижается до нуля, затем возрастает. При достижении значения pOj, равного 40%, включают подачу подпитки, которую .подают в атшарат до тех пор, пока р02 не снижается до 15%. Подачу подпитки начинают на 28 ч ферментации. Объем подпитки, потреблениый в течение ферментации, равен 450 мл. Послг 48 ч ферментации в купьтуральной жидкости накапливается 9,7 г/л L-триптофана, который выделяют следующим образом. 1 л культуральиой жидкости, освобожденн от биомассы, с концентрацией . триптофана 9,7 г/л направляют на колонну с 0,250 л сорбента - слабоосновного анионита конденсационного типа (колсоша IHA). Перед промывкой к выходу колонны 1 И подсоединяют вторую колонну с ИА-1р (колонна 2 ИА содержит 0,250 л сорбента). По окончании промывки колонну 2 ИА отсоеди няют, а к выходу колонны 1 ИА подсоедиияют колонну с сульфокатионитом (колонна 1 КУ содерядат 0,1 л. сорбента) и проводят элюирование. Промывку колонны 1ИА и элюирование из нее триптофана осуществляют водой, пропуская 0,5 и 2,5 л воды, соответственно. Дальнейшее элюирование триптофана из колонны 1 ИА ведут раствором, выходящим из колонны 1 КУ. Объемная скорость пропускания раствора, циркулирующего по системе из двух колонн, сост ляет 0,25 л/ч, продолжительность указанной операции составляет 10 ч. Очередную порцию (1 л) кулыуральной жидкости наТ1равляют на колонну 2 ИА. Перед промывкой ко входу колонны подсоеднняют колонну 1 ИА, а к выходу - третью колонну с ИА-1р (колонна 3 ИА. содержит 0,25 л сорбента). По окончании промывки колонны 2 ИА водой колонну ЗИА отсоединяют, а к выходу колонны 2 И А подсоединяют колонну 1 КУ. Элюент (воду), взятый в количестве 2,5 л, пропускают через последовательно соединенные колонны 1 ИА, 2 ИА и 1 КУ. Дальнейшее элюирование (пересорбцию) триптофана из колонны 1ИА и 2ИА на колонну 1 КУ ведут, соединяя колонны 2ИА и 1 КУ, в замкнутую систему. Сорбен в колонне 1 ИА подвергают регензрации. Очередную порцию культурапьной жидкости (1л) обрабатывают аналогично вышеописанному с использованием колонн 3 ИА 1 ИА (смола отрегенирована, колонна Подсоединяется к выходу из колонны 3 ИА при промывке), 2 ИА (подсоединяется ко входу колсяшы 3 ИА при промывке и элюир вашш) и 1 КУ (подсоединяется к выходу колонны 3 ИА при злюировании). Пересорб цию триптофана проводят, подсоединив к выходу колонны 1 КУ другую солонну с - сорбентом КУ-2-8 (колонна ГкУ содержит 0,1 л сорбента). Таким образом, раствор циркулирует по системе, состоящей из после довательно соединенных колонн 3 ИА, 1 КУ и 2 КУ (колонна 2 ИА отсоединяется и сорбент регенерируется). Элюирование трштофана с колонны 1 КУ ведут водно-этанольным раствором аммиака при температуре 70°С. После обработки богатой фракщш злюата уксусной кислотой и охлаждения до 0°С получают кристалл L-триптофана. После высушивания при температуре 50°С получают 17,2 г .L-триптофана с содержанием основного вещества более 99%. После описанных операций по выделению триптофана из трех литров культуральной жидкости На колоннах 3 ИА и 2 КУ остается сорбированный тргаггофан в.количестве 3,5 г. Триптофан также содержится в бедных фракциях аммиачного элюата и в аммиачно-зтанольном маточнике полученном после отделения кристаллов триптофана, в количестве 3,5 г. С учетом триптофана, который может быть довыделен в после дующих технологических циклах, общий выход триптофана составляет 70%. Преимущества предложенного способа состоят в том, что в способе достигается значительная экономия обессоленной воды, аммиака и этанола за счет того, что малоконцентрированные фракции элюата используют в качестве элюента в последующих териологических циклах для десорбции L-триптофана с анионита и сульфокатионита. За счет этого удается также снизить потери продукта при выделении. Полученные богатые фракции элюата нейтрализуются уксусной кислотой при охлаждении, при этом триптофан выпадает в виде кристаллов, которые выделяют фильтрованием и высушивают. Маточный раствор направляют для сорбции на колонну с анионитом. Суммарный выход триптофана достигает 70%. Содержание основного вещества в полученном препарате не менее 96%, а после перекристаллизации не более 99%. Предлагаемый способ получения 1.-триптофана имеет следуюиие преимущества по Сравнению с известными способами: более высокий уровень накопления триптофана на средах со стандартным источником углеводов - сахарозой или сахаром (9-11 г) по сравнению с 3,6 - 4|6 г/л); сокращенный период ферментации, достигаемый введением питательной дЬбавки (48 ч по сравнению с 72 ч); в способе усовершенствована стадия выделения и очистки -триптофана, что позволяет в значительной степени уменьшать расходы обессоленной воды, аммиака и других реагентов на этой стадии.

99081412

Выход L-триптофана после 48-68 ч

ферментации в колбах емкостью 250 мл при 37° С на среде с 10% сахарозы,

,6,16,6

7,39,6

{0 Таблица2

2136 I 48

2,0 .6,48,610,7

0,170,290,2320,22

Примечание, t- время ферментации;

Т- уровень накопления L-триптофана; T/t - скорость накопления. Формула изобретения Способ получения L-триптофана путем глубинного культивирования продуцирующих его лмкроорганизмов вида Bacillus subtil is в условиях аэрации на питательной среде, содер жащей углеводы в качестве источника углеро да, источники азота, фосфора, ростовые вещества и необходимые; минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости с помощью ионного обмена и кристаллизацией, отличающийся тем, что, с целью повыщепия выхода L-тритофана, из микроорганизмов вида Bacillus subtilis используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15,

Таблица 1 10 мл среды, г/л

48 чI68 ч при этом в процессе культивирования в среду вводят концентрированную питательную добавку, содержащую источники углерода, неорганического азота и ростового вещества, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации растворенного кислорода в среде 10-40%. Источники информации, принятые 80 внимание при экспертизе 1.Патент США № 3849251, кл. 195-29, опублик. 1974. 2.Авторское свидетельство СССР №745889, кл. с 12 Р 13/22, 1977. 3.Авторское свидетельство СССР № 480758, кл. с 12 Р 13/22, 1972.