Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений Советский патент 1985 года по МПК B01J21/00 C07H19/00 C07K17/14 C12N11/14 

Изобретение относится к способам получения водонерастворимых биологически активных соединений на кремнеземной основе. В качестве биологически активных соединений используются ферменты, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды белки, липиды и т.д. Такие препарат могут быть использованы в пищевой, медицинской и других отраслях промы шленности, а также в научных исслед ваниях. Известен способ получения фермен тов иммобилизованных на кремнеземны носителях, предварительно покрытых органическими полимерами (нейлоном, полиакрилатом, поликарбамидом) . Однако стабильность получаемы препаратов невысока, что, возможно, связано с удалением органического покрытия или с растворением самой кремнеземной основы. Известен также способ получения водонерастворимых; биологически акти ных соединений на кремнеземной осно ве, включающий модификацию кремнезе ной основы путем покрытия гидрофиль ными органическими полимерами, последующую, в случае необходимости, активацию модифицированного носител и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений, например ферментов, липидов, нуклеотидоВо Модификация кремнеземной основы заключается в том, что ее подвергают действию ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-100 рад/с при 55-65 С в при сутствии паров виниловых мономеров при давлении 35-400 мм Ичг, Активаци модифицированного носителя обычно осуществляют с помощью бифункционал ных реагентов, например диаминов, диальдегидов, дихлорангидридов. Однако указанньм способ имеет следующий недостаток. Полученные этим спо собом водонерастворимые препараты не обладают достаточной стабильност в водных средах. Это объясняется тем, что кремнеземная основа при рН 7 начинает растворяться и это особенно сказьшается в длительных процессах. Гидрофильное органическое покрытие не защищает кремнеземную основу от растворения, что прив дит к постепенному падению емкости носителя и уменьшению активности по лученных биологически активных препаратов. Целью предлагаемого изобретения является повьшение стабильности водонерастворимых биологически активных соединений в водных средах. Указанная цель достигается тем, что в известном способе перед модификацией кремнеземную основу предварительно гидрофобизуют обработкой ее кремнеорганическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы либо действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 80100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Hg и температуре 50-60 С. Повышение стабильности связано с уменьшением растворения кремнеземной основы, экранированной гидрофобным покрытием. Для того, чтобы гидрофобное покрытие защищало кремнеземньй каркас от растворения в водных средах, оно должно быть достаточно плотным, чтобы препятствовать диффузии молекул воды к каркасу, и должно быть связано с основой прочными ковалентными связями. Получение такого покрытия достигается обычно путем кипячения основы в растворе гексаметилдисилазана или прививкой к поверхности гидрофобного полимера полистирола. Согласно изобретению описывается способ получения водонерастворимых биологически активных соединений, включающий гидрофобизацию кремнеземной основы путем обработки ее кремнеорганическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы, например гексаметилдисилазаном, либо действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 80-100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Hg и температуре 50-60С, модификацию гидрофобизованной основы действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 4050 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм температуре 35-65 с, последующую в случае необходимости активацию модифицированного носителя (обычно с помощью бифункциональных реагентов, например диаминов или диальдегидов, или дихлорангидридов) и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений (ферментов, нуклеотидов, кофакторов). Обычно для гидрофобизации в качестве кремнеорганического соединения, содержащего триметилсилильные группы, используют гексаметилдисилазан, а обработку им кремнеземной основы осуществляют при кипении Описьшаемый способ дает возможность получать стабильные водонерастворимые биологически активные соединения, так как кремнеземный каркас получаемых соединений экрани рован от воздействия воды гидрофобным покрытием, Водонерастворимые биологически активные соединения, полученные да ным способом, не теряют своей акти ности в результате вьщерживания в течение 100 ч при 37 С в буфере 0,1М трис-НСе рН 8,0, в то время как активность соединений, получен ных без гидрофобного покрытия, снижается в тех же условиях на 20-50% в результате растворения кремнезем ной основы. Пример 1. Макропористый кремнезем (30 г) суспендируют в 100 мл абсолютного гексана, добавляют 40 мл гексаметилдисилазана и кипятят 2 ч. Носитель промывают на фильтре гексаном (500 мл) и высушивают в вакууме, Полученньй гидрофобизированный носитель помещ ют в стеклянную ампулу и откачиваю до остаточного давления многократном замораживании и размо живании. Носитель в ампуле облучают v-Co в течение 2 ч при мощности дозы 40-50 рад/с в присутств паров акриловой кислоты. Процесс проводят при температуре 60-65 С и давлении паров акриловой кислоты 35-40 мм Hf, Полученный носитель о мывают кипящим метанолом до постоянного веса. Получают производное с содержанием углерода до 20% не концентрацией карбоксильных групп до 3 ммоль на 1 г носителя. Носитель 1 (2 г)суспендируют в 5 мл в ды, добавляют 200 мг 1-циклогексил 3-(2- морфолиноэтилкарбодиимида wтолуолсульфоната) (водорастворимог карбодиимида), поддерживают рН 4,5 6,0 и прибавляют 100 мг панкреатической рибонуклеазы. Реакционную смесь перемащивают на качалке при 0-5°С в течение 4 ч. Водонераствор мый продукт промывают на фильтре 1М КаС и водой до отсутствия белк в промывках. Водонерастворимьшг продукт содержит 40 мг белка на 1 г носителя, сохраняя до 80% исходной активности. В течение 10 дней работы фермента в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,5) не наблюдается потерь активности. Пример 2, Производное 1 (4 г) (см.пример 1) суспендируют в 100 мл абсолютного метанола, насьпценного НС, и кипятят 2 ч. Промывают метанолом (500 мл), суспендируют в 100 мл абсолютного тетрагидрофурана, содержащего 1 г LiAPH, и кипятят при перемешивании 8ч. Полученный носитель промывают тетрагидрофураном (200 мл), эфиром (200 мл) и высуиивают на фильтре ацетоном. Носитель (2 г) суспендируют в 100 мл воды при рН 5,5-6,0; добавляют 800 мг водорастворимого карбодиимида и 200 мг уридин-5-монофосфата. Перемешивают 4 ч и отмывают на фильтре Ш NAC6 и водой до отсутствия поглощения при Л 260 нм. Водонерастворимый П1/одукт содержит до 50 мг нуклеотида на грамм носителя и стабилен в водных растворах при рН 2-8. Пример 3. Макропористый кремнезем (30 г) помещают в стеклянную ампулу и откачивают до остаточного давления 10 мм Hij-при многократном замораживании и размораживании. Носитель в ампуле облучают рентгеновскими лучами на установке ТРЦ-ЗА в течение 3,5 ч при мощности дозы 80-100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм ti- и температуре 50-60°С. Полученный носитель отмывают толуолом до постоянного веса и высушивают. Гидрофобизированный носитель вновь подвергают облучению и проводят прививочную полимеризацию акриловой кислоты (см,пример 1). Получают носитель 2 с содержанием углерода до 20% и с концентрацией карбоксильных групп до 2 ммоль на 1 г носителя. Носитель 2 суспендируют в 250 мл метанола, насыщенного хлористым водородом, и кипятят 2 ч при перемешивании. Носитель промывают водой, суспендируют в 200 мл воды и добавляют 30 мл гидразингидрата. Реакционную массу кипятят 3 ч, промывают водой до отрицательной реакции на саициловый альдегид в промывках. Полу$75080Д . «

ченное производное суспендируют вNaCf и водой до отсутствия поглоще10 МП 0,1 М ацетатного буферания при Л 260 им в промывках. Им(рН 5,0), содержащего 200 мг окис-мобилизованный препарат содержит до

ленного периодатом НАДФ. Перемеши-50 мг НАДФ на 1 г носителя и стабивают 2 ч, промывают на фнпьтре 1 Мпен в водныхсредах при рН 5-8.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТБОРИМЫХ БИОЛОгаЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, включающий модификацию кремнеземной основы при 55-65°С действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-50 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35-40 мм Н, последующую, в случае необходимости, активацию модифицированного носителя и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевых продуктов в водных средах, кремнеземную основу перед модификацией подвергают гидрофобизации путем обработки ее кремнеорганическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы, или действием ионизирукицего излучения с мощностью дозы 80-100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Hg- и температуре 50-60 0. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве биологически активных соединений используют ферменты, нуклеотгады, кофакторы. 3.Способ по П.1, отличающийся тем, что активацию модифицированного носителя осуществляют (Л бифункциональными реагентами. 4.Способ по пп. 1 иЗ, отличающийся тем, что в качестве бифункциональных реагентов используют диамины, или диальдегиды, или ел дихлоран гидриды. 5.Способ по п. Г, отличаюо щийся тем, что в качестве крем00 неорганического соединения, содержащего триметилсилильные группы, исо пользуют гексаметилдисилазан, а об4i работку им кремнеземной основы осуществляют при кипении.