Способ получения биоспецифического сорбента Советский патент 1983 года по МПК C07H19/20 B01J20/22 C07G7/00 

ел ел

Изобретение относится к спосо,бам получения биоспецифических сорбентов, используемых в аффинной хроматографии ферментов, имеющих сродство к компонентам нуклеиновых кислот.

Известны способы получения биослецифических сорбентов, содержащие в ка- честве иммобилизованного лиганда .нуклеозид-3,5-дифосфаты, Например, известен способ/получения сорбента на основе гуанозин-2(3) ,5 дифосфата, согласно которому носитель - пористое- стекло подвергают взаимодействию с 3-аминопропилтризтоксисиланом в течение 6 часов, полученное аминопрошшированное стекло обрабатывают р-1штробензоилхлоридом, восстанавли.вают нитрогруппу дитионитом натрия в водном растворе. Полученное аминоарильное производное стекла диазотируют, затем добавляют 1,5-диоксипафталин из расчета 100 мг на I г сорбента в растворе ацетата натрия, иафталичсодержащее стекло от(1ильтровывают на фильтре. В качестве лиганда используют 5-(4-аминофенилфосфорил)гуанозин-2(37-монофос.фат, который получают конденсацией гуанозин-2, 3-циклофрсфата с р-нитрофенилфосфатом с использованием в качестве конденсируюО0 p-o-T/° ОН Cetpapo3a Q-C-т

Однако известный способ имеет ряд недостатков, связанных со сложностью и трубоемкостью получения используемого лигавда, синтез которого основан на использовании дефицитных веществ (11апример, фермента фосфодиэстерезы из змеиного, яда) и длится несколько дней, после чего непосредственно осуществляют синтез сорбента; необходимостью использования в качестве носителя BrCN-активированной сефарозы (BrCN, как известно, является высокотоксичным соединением.

щего агента дицнклогексилкаободиимида. Нитрогруппу восстанаиливают до аминогруппы катсшитическим гидрирова1шем 10%-ным паллгщнем на . Полученный лигг:нд диазотируют и смешивают с нафтальнсодержащим О НзО нн II

Нз02Р,Н

сорбенты на основе сефарозы не обладают достаточной механической прочностью и :хи шческой СТОР:КОСТЬЮ. Кроме того, образующаяся в гроцессе- связь

между а1 шнами и BrCN-c

ефарозой не достаточно прочна и в присутствии нуклеофилов лабильна, что затрудняработу с данными сорбентами ет Цель изобретения - упроще1ше способа и повышение химической стойкос ти сорб«5нта.

Указанная цель достигается тем,

что согласно способу получения бностеклом в 0,5 М бикарбонатном буфере рН 9,0. Реакцию проводят в т.ечение 1 ч при , биоспецифический сорбент отделяют фильтрованием П . Однако данный способ получения биоспецифического сорбента очень сложен и трудоемок. Синтез сорбента занимает не менее двух недель. Используемая в способе обработка стекла З-аминопропилтриэтоксисиланом влияет на проявление сорбентом анионообменныХ свойств, что снижает селективность очистки. Наиболее близок к предлагаемому по техгшческой сущности способ получения биоспецифического сорбента на основе уридина, который заключается в том, что лиганд -производное фос, - .-„ --.--- форилированного уриди на связывают с носителем - BrCN-активированной сефарозой при и рН 9,0 2. Схема получения данного сорбента мoxceт быть выражена следующим обра зом: . -ь ВгСН-Сефорозо Н

310575

специфического сорбента путем связыва1гия лиганда на основе уриднна с носителем в качестве лигавда использурот 5-оксиуридин-2 (З; 5 -дифосфат, в качестве носителя - модифицированный 5 солями алюми1шя макропористый кремI 1. Tf-эпоксипропилсилан 2. НС1

SiOJ-0-Si-(CHj,)3 O 0

,.

Z. Н

14Л

(Незем с диазотироваиными аминоарильными группами, а процесс осуществляют при и рН 6-8.

Способ осуществляется по следующей схеме (показаны и стадии подготовки носителя и синтеза лиганда);

SiOzj-O-Si-f CHjjs OCHjCHCHzO-C-YOV

feo2)-0-Si-(CH2)3 ОСН2СНСН20-СД А

о

тТ

Синтез лиганда начинают с введения гидроксильной группы в пятое положение пиримидинового ядра. Для этого уридин растворяют в бромной воде и обрабатывают свежеперегнанным пиридином при нагревании до 120 С в течение 5-12 ч. Затем реакционную массу упаривают и остаток кристаллизируют из этанола. Полученный 5-оксиуридин тщательно высушивают над РоОу и фосфорилируют полифосфорной кислотой при 55 80 С в течение 4 ч. Затем избыток полифосфорной кислоты разлагаютПводой при 120с, а продукт фосфорилирования

POgHjiH

выделяют анионаобменной хроматографией.

Синтез сорбента ведут исходя из кремнеземов, модифицированных солями алюминия з, покрытых органическими полимерами с гидроксильными группами. Органические полимеры на поверхность кремнеземов вводят, обрабатывая кремнезем силаном, содержащим |Эпоксигруппы которые при размыкании дают диольную группировку. Для вве дения аминоарильной группы гидроксил..содержащие органокремнеземы в кипящем толуоле обрабатывают в течение 3 ч р-нитробензоилхлоридом с добавлением триэтиламина. Нитрогруппу во станавливают дитионитом натрия при бО-ЗО С в течение 2 ч. Полученный сорбент суспендируют в 2,5 н.солячой кислоте, добавляют нитрит натрия и перемешивают 30 мин при , тем промывают буфером при рН -8 и активированный сорбент суспендируют том же буфере, содержащем 5-оксиуриди 2 (,3) 5 дифосфат и перемешивают при в течение 4-12 ч. Предлагаемый способ более прост и менее трудоемок, не требует использования высокодефицитных и токс ных реактивов как в процессе получе ния самого сорбента, так и в процес се синтеза исходных. Общая продолж тельность в 4 раза меньше, чем в и вестном способе (учитывая стадии по готовки лиганда и носителя), ТВиоспецифич ский сорбент, получа мый предлах аемым способом, обладает высокой химической стойкостью, так как не содержит гидролитически ла|бш1ьных связей, как в случае био- . специфического сорбента, получаемого по способу прототипу. Высокая- химическая стойкость возрастает также вследствие использования модифицированной солями алю ния кремнеземной основы . Стабильность кремнеземного сорбента после такой модификации возрастает в 10 и более раз. Кроме того, получаемый сорбент характеризуется низкой неспецифической сорбцией (менее 10 мг белка на 1 г сорбента) , так как в спрсоб е предусмотрена обработка кремнеземной основы неионногенными органическими полимерами, а кроме того, иммобилизованный лиганд удален в два раза дальше от поверхности нерастворимого носителя, чем в способ прототипе. Пример Г. 3 г уридина растворяют в 15 МП воды, добавляют бром до слабого пожелтения раствора, при дивают 15 мл пиридина и раствор нагревают в течение 5 ч при Затем упаривают насухо и остаток кристаллизуют из этанола. Получают 1,3 г 5-оксиуридииа, которьот высушивают 6 ч над Р Ос в вакууме масляного насоса, а затем растворяют . в 25 г полифосфорйой кислоты и пере мешивают 4 ч при 80 С до образования прозрачной гомогенной массы. Добавляют 20 мл воды и раствор нагревают 20 мин при 120 С. Охлаждают и доводят рН до 10 с пoмdJцью 4,5 н. гидроокиси лития. Осадок отфильтровывают, и супернатант. содержащий продукты фосфорилирован|ия, наносят на анионообменник и разЬеляют обычным способом. Получают ll г 5-оксиуридин-2(з) 5-дифосфата1. К 25 г модифицированного солями алюминия сьлохрома в 350 мп толуола добавляют 10 мл 3 (2, 3-эпoкcипpoпoJccи)-пpoпилтpимeтoкcиcилaнa, кипятят при перемешивании 8 ч, промывают толуолом и ацетоном, суспендируют 500 мл раствора НС1 в ацетоне 0,1 koль/г и перемешивают 2 ч при 20С. форбент промывают на фильтре ацетоно, высушивают в вакууме масляного rtacoca, суспендируют в 250 мп абсолютного хлороформа, содержащего 12,5 |г хлорангидрида р-нитробензойной кислоты и 9,4 мл триэтиламина. Смесь при перемешивании 3 ч , отмывают на фильтре хлороформом, ацетоном и водой и суспендируют в 300 мл 10%-ного водного пиридина, содержащего 12j, 5 г растворенного днтионита натрия| (NanSjO) и нагревают при 60-80 0 b течение 2 ч. Аминоарильное производное органсилохрома промывают ни. фильтре водой и суспендируют в 500 мп 2,5 н. НС 1. Смесь охлаждают до , прибавляют 10 г NaN02 перемешивают 30 мин, промывают 0,2 М ацетатным буфером при рН 7,6, зате1 1 суспевдируют в 200 мл того же буфера, со, п / держащего 1 г 5-оксиурид1 н 2(з) 5-дифосфата и перемешивают С в течение 12 ч. Синтезированны .биоспеци- фический сорбент промывак||Т 1 М NaC I, водой и ацетоном и высушивают в вакууме масляного насоса. Сорбент содержит около 35 ммоль лилавда на I г сорбента, П р и М е р 2. Процесс ведут аналогично примеру 1, но 5-оксиуридин2 (З) 5-дифосфат берут в количестве 0,2 г. Синтезированный бирспецифиче- ский сорбент содержит 7 лиганда на 1 г сорбента. П р и М е р 3. Процесс ведут аналогично примеру 1, но присоединение лиганда к активированному сорбенту ведут в течение 4 часов пои . П р и М е р 4. Процесс I ведут аналогично примеру 2, но присоединение лигавда к сорбенту проводят при рН 6.

,710575148

Использование предлагаемого сПосо-неземной основы неионогенными органиба позволяет iполучать биоспецифиче-ческими полимерами; высокой селективские сорбенты, т.е. сорбенты для взаи-ностью взаимодействия вследствие знамодействия с белками, имеющими срод-чительной удаленности иммобилизованство к компонентам нуклеиновых кислот. 5ного лиганда от поверхности кремнезеПолучаемые предлагаемым способомма в результате однозначности связы6иос1 ецифические сорбенты характери-вания лиганда с сорбентом, эуются высокой химической и микробио- В предлагаемом способе использулогической устойчивостью из-за исполь-ется носитель, выпускаемый отечест-

зования кремнеземной основы; низкой 10венной промышленностью, что позволянеспехщфической сорбцией, так как вет осуществить крупномасштабное произспособе предусмотрена обработка крем-водство биоспецифического сорбента.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИдаЧЕСКОГО СОРБЕНТА путем связывания лиганда на основе уридина с носителем, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения химической стойкости сорбента, в качестве лиганда используют 5-оксиуридин ) Б дифосфат, в качестве носителя - модифицированный солями алюминия макропористый кремнезем с диазотированными аминоарильными группами, а процесс .осуществляют при и рН 6-8. (Л