Способ иммобилизации транскортина Советский патент 1981 года по МПК C12N11/00 

стероид, агарозу и транскортин берут в соотношении 1:0,002-1:0,03, инкубируют смесь в течение 3-24 ч при 4-23°С, а иммобилизированный транскортин промывают фосфатным буфером при рН 6-8, содержаш.им стероид в концентрации, равной его содержанию при иммобилизации транскортина.

В качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с траискортином 1:0,5-1:3 или кортиокостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5- 1:2, или прогестерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:1.

Способ заключается в следующем.

Гомогенный транскортин, выделенный из плазмы ретроплацентарной крови человека аффинной хромотографией, растворяют в фосфатном буфере рН 8,0. Для предотвращения инактивации транскортииа в процессе иммобилизации его связывают со стероидом, имеюшим высокое сродство к этому белку. Полученный комплекс смешивают с активированной бромцианом агарозой. Процесс иммобилизации проводят нри непрерывном перемешивании в течение 3-24 ч при 4-23°С. Нековалеитно связанный с агарозой траискортин удаляют путем последовательных про.мывок транскортин-агарозы фосфатным буфером, содержашим 0,5 М NaCI, трис-ПС1 буфером рН 8,0 (для блокирования остаточных активных групп агарозы) и фосфатным буфером рН 8,0. Все промывающие буферы содержат растворенный стероид для предотвраш.ения диссоциации обратимого комплекса транскортин - стероид, им.юбилизованного на агарозе. В результате получают стабильную трехкомпонентную систему агароза-транскортин-стероид. Ковалентная связь .между первыми двумя компонентами устойчива к физическим воз действиям, а стероид легко переходит в раствор при повышении температуры до 35-40С. При необходимости удаляют определенную часть стероида, варьируя тем самым в широких пределах (от 10 до 90%) стерондосвязывающую емкость иммобилизованного транскортина.

Пример 1. Иммобилизация транскортина нри о.хлаждении.

10 мг (2, моль) транскортииа растворяют в 5 .мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М NaCI и охлажденного до 4-6°С. В полученный раствор добавляют 144 мкг (4- 10 моль) кортизола в 0,2 мл абсолютного этанола. 1 г агарозы, активированной бромцианом, промывают на пористом стеклянном фильтре последовательно 200 мл 0,001 М HCI. 50 мл воды, 10 .мл ОЛ М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М NaCI. Все растворы имеют температуру 4-6°С. К гелю промытой активированной агарозы приливают полученный, как описано выше, раствор комплекса транскортии-стероид. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке нри 4-6°С в течение 24 ч. Гель переносят в стеклянную колонку, снабженную пористым стеклянным фильтром, и нро.мывают последовательно 40 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М NaCI, 40 мл 0,01 М трисHCI буфера рН 8,0 и 20 мл 0,1 М иатрийфосфатного буфера рН 8,0. Все промывающие буферы имеют температуру 4-6°С и содержат кортизол в концентрации 29 мкг/мл. Химический анализ и определение стероидсвязывающей способности (см.

пример 6) показывают, что Б препарате иммобилизованного трапскортина 1 г агарозы ковалеитно связан с 9,2 мг белка и стероидсвязываюшая способность составляет 85% от стероидсвязывающей способцости того же количества нативного (неиммобилизованного) транскортина.

Пример 2. Иммобилизация транскортииа при комнатной температуре.

Используют все те реагенты и реактивы, что и в примере 1, в тех же количествах. Проделывают все те операции, что и в примере 1, в той /ке последовательности, но при температуре 20-23°С. Время пе|)емешивация суспензии 3 ч. Проведенный

анализ показывает, что 1 г агарозы ковалентно связан с 9,0 мг траискортина, а стероидсвязывающая способность сохраняется на 81%.

Пример 3. Влияние исходного соотношения транскортина и агарозы на количество иммобилизованного белка и его стероидсвязывающую способность.

В целях подбора оптимального соотношения количеств белка и активированной

агарозы к шести пробам активированной агарозы (по 0,1 г) добавляют различные количества транскортипа, растворенного в 0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М NaCI. Кал{дая проба раствора транскортииа, как и в примере 1, содержит двойное количество кортизола в мольно.м отношении к количеству белка. Процесс для пробы проводят, как описано в примере 1, но объемы промывающих буферов уменьшают в 10 раз. Результаты анализа полученных нрепаратов транскортин-агарозы представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, наиболее

эффективно иммобилизация транскортина проходит при таком соотношении количеств активированной агарозы и белка, когда на 0,1 г матрицы взято 1,0 мг транскортина. При указанном соотношении реагентов сохраняется иммобилизованным транскортином высокая стероидсвязываюП1ая активность.

Пример 4. Стабилизирующее ьлияние различных количеств стероида на активность иммобилизованного транскортина.

Таблица 1

Стероидсвязьшающая способность иммобилизованного транскортина приведена в процентах от связыв.ающей способности нативного белка (то же в соответствующих графах табл. 2 н 3).

Для подбора оптимального мольного соотношения транскортина н стабилизирующего стероида к пяти пробам по 1,0 мг белка, растворенного в 0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0 и содержащего 0,5 М NaCI, добавляют различные количества стероида. Процесс для каждой пробы проводят, как описано в примере 1, используя 0,1 г активированной агарозы и у.меньн1ая объемы промывающи.х буферов в 10 раз. Каждый промывающий буфер содерл ит стероид в той же концентрации, какая была создана в данной нробе транскортина. Результаты анализа полученны.х препаратов транскортин-агарозы представлены в табл. 2.

Таблица 2

Стерондсвязывающая способность, %

Из данных табл. 2 следует, что наибольшее стабилизирующее влияние оказывает стероид Б мольном отношении к белку 2:1 ( 14,4 мкг кортизола на 1,0 мг транскортина). Другие стероиды, имеющие средство к транскортину одного порядка с кортизолом - кортикостерон и прогестерон - также стабилизируют транскортин в процессе его иммобилизации. Используют мольные соотношения кортикостерон:транскортин 2:1 и прогестерон:транскортин 1:1. Стабилизирующее влияние обоих стероидов равно влиянию эквивалентного количества кортизола.

Пример 5. Влияние рН промывающего буфера на стероидсвязывающую способность иммобилизованного транскортина м на количество белка, связанного активированной агарозой.

От значения рН промывающего буфера зависят, во-первых, полное удаление нековалентно связанного с матрицей трапскортина и, во-вторых, сохранение при этом высокой стероидсвязывающей способности белка. С этой целью проводят иммобилпзацию пяти проб по 1 мг транскортина иа пяти пробах по 0,1 г активированной агарозы в соответствии с примером 1. По окончании реакции данную пробу промывают буфером с исследуемым значением

рН. Затем промывку ведут, как в примере 1, уменьщая объемы в 10 раз. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-агарозы приведены в табл. 3.

Т а б л н ц ,ч о

Из данных табл. 3 видно, что промывка

транскортин-агарозы буферами с низким значением рН (4,0) существенно инактивирует белок. Химический анализ полученных препаратов показывает, что все пробы содержат одинаковое количество

белка (в пределах ошибки эксперимента). Следовательно, нет необходимости понижать рН для увеличения десорбирующей силы промывающего буфера (как рекомендует унифицированная методика иммобилицации белков).

При.мер 6. Химический анализ иммоби лизации белков).

Суспензию транскортин-агарозы в воде лиофильно высущивают и определяют сухой вес црепарата. Пробу 0,02 г сухого препарата подвергают полному кислотному гидролизу в 6 н. НС1 при 110°С в течение 48 ч. В контрольном опыте 0,02 г неактивированной агарозы и известное количество транскортина гидролизуют в идентичных условиях. Состав гидролизата определяют на аминокислотном анализаторе в стандартных условиях. Количество иммобилизованного транскортина определяют

сопоставлением количеств глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и аланина, высвободившихся при гидролизе в опытной и контрольной пробах.

Определение стероидсвязывающей сиособности иммобилизованного транскортина

проводят по предлагаемому способу. Стероидсвязывающую способность пативного трапскортпна измеряют по общепринятой методике с применепием твердофазной адсорбции для разделения свободной п связанпой трапскортнном форм стероида.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность {92--95%) иммобилизации транскортпна на нерастворимой матрице и позволяет сохранить высокую стероидсвязывающую активность белка (81-85%). Такое сочетание названных параметров необычно даже для достаточно стабильных белков.

В получаемом по предлагаемому способу препарате иммобилизованного трапскортина отсутствуют примесные белки, конкурирующие с транскортином за стероид. Это обусловливает более высокое специфическое сродство транскортина к стероидам и большую удельную стероидсвязывающую способность по сравнению с целевым продуктом, полученным по известному способу. Иммобилизованный гомогенный транскортин может храниться при 4-б°С по меньшей мере в течение 8 месяцев без изменения стерондсвязывающей способности. При получении препарата проводят на всех стадиях процесса иммобилизации операции по стабилизации белка.

Примепенпе в. предлагаемом способе фосфатного буфера с рН 6-8 для растворения гомогенного транскортина, для промывки транскортин-агарозы и для последующего хранения препарата основано, во-первых, на известном факте стабильности гомогенпого транскортина в этом буфере и, во-вторых, на том, что этот буфер используют при очистке транскортина до гомогенного состояния. Связывание со стероидом обеспечивает высокую стабильность белка в процессе иммобилизации, а диссоциация лиганда предотвращается введением стероида в промывающие буферы.

Использование равных концентраций стероида в растворе транскортина и промывающих буферах обеспечивает ту же концентрацию (известную) стероида в полученном препарате. Это облегчает количественные расчеты при работе с иммобилизованным гомогенным транскортином.

Форм у л а и 3 о б |) е т с п и я

1.Способ пммобплизапии транскортпна путем его растворения с последующим добавлением в раствор активпровашюй нерастворимой агарозы, инкубацией полученной смеси и промывкой образовавшегося иммобилизованного трапскортина, отличающийся тем, что, с целью получения стабильного гомогенпого препарата п повышения его связующей емкости, в раствор транскортина перео; добавлением aiapO3bi вводят стероид, агарозу и транскортин берут в соотпошенпп 1:0,002-1:0,03, инкубацию смеси ведут в течение 3--24 ч прп 4-23°С, а нммобилизованный транскортин промывают фосфатным буфером при рН 6-8, содержащим стероид в копцентрапли, равной его содержанию прп иммобилизации транскортипа.

2.Способ по п. 1, от л п ч а Сущ и йся тем, что в качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:3.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стероида используют кортикостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:2.

4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стероида используют прогестерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5-1:1.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка Великобритании N° 1348935, кл. С 07 G 7/00, 1974.