Способ получения над-зависимой алкогольдегидрогеназы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Описание патента на изобретение SU763464A1

1

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно, к способам получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей. Изобретение может найти применение в фармацевтической и медицинской промышленности, а также в научных исследованиях.

В последние годы было показано, что НАД-зависимая алкогольдегидрогеназа из печени человека, лошади и пекарских дрожжей обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует наряду с окислением этанола и окисление метанола.

Способна окислять метанол и НАДзависимая дегидрогеназа из метанолокисляющих дрожжей 1.

Однако активность по метанолу НАДзависимой алкогольдегидрогеназы из названных источников очень низка.

Получение НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы с высокой активностью по метанолу имеет,кроме чисто научного, также практическое значение. Окисление метанола с помощью НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы может найти применение в процессах, в коTjoptix необходима регенерация кофактора, а именно НАДН. Это многие биохимические окислительные процессы, например получение аминокислот, модификация стероидов и т.д. Перспективным является также создание биоэлектрохи- Мичёских систем окисления различных органических соединений для создания топливных элементов, в - которых НАДН выполнял бы роль переносчика злектронов с органических соединений на электрод.

Наиболее близким к изобретению является способ получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей Pichia pinas, предусматривающий культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение:фермента 2.

Недостатки способа: низкая актив25 ность фермента по отношению к метанолу, составляквдая 402 нмоль/мг белка-мин; периодические условия культивирования, которые не позволяют поддерживать культуру в одном и том

30 же физиологическом состоянии с высокой феЕментативной активностью;, применение в качестве источника углерода метилового спирта усложняет культивирование в промышленных масштабах, так как он летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола. Цель изобретения - повышениеметанолокисляющей активности фермент и эффективности процесса. Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют дрожжи Candida methylica ИБФМ У-670 а культивирование ведут в проточных условиях, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01-0,1 об.%. . Повышение эффективности процесса происходит за счет того, что культивирование в условиях Протока позволя ет получать большие количества биомассы, а также поддерживать культуру в одной и той же фазе роста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения фермента с высокой метанолокисляющей активностью. Эффективность процесса повышается и за счет использования в качестве источника углерода этилового спирта, что упрощает технологию. Способ осуществляют следующим образом. Дрожжи Candida methylica ИБФМ ,670 культивируют да синтетической питательной среде следующего состава: (NHjLHPO. 0,5 г/л; КНдНгРОд. 1,5 г/л; KN02,4,0 г/л; MgSO4 0,25 г/Л дрожжевой автолизат 0,01 г/л,-этиловый спирт 0,01-0,1 об, %. Культивирование проводят в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавления 0,1-0,05 ч при аэрации, рН среды 6,0. Для выделения фермента биомассу разрушают путем растирания стеклянными бусами и центрифугируют, супернатант хроматографируют на ДЕАЕ-целпюлозе. Активность полученного препа рата по метанолу 7100 нм/мг белкаМи П р и м е р 1.В качестве продуцен га используют метило трофных дрожжей Candida-methyJica ИБФМ У670,который хранится в коллекции ин ститута биохимии и физиологии микро организмов АН СССР в г,Пущино-на.гЬк Штамм защищай авторским- свидетельством № 449933, кл. с 21 Q 11/18, Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава,г/л: (NH4)HP04 0,5 NH4H2P04 1,5; KNO 4,0; МдЗОд 0,25; дрожжевой автолизат 0,01. Вода дистиллированная. Значение рН среды доводят соляной кислотой до 0,0. Стерилизацию среды проводят при 1 атм 20 мин, В качестве источника углерода используют эти новый спирт, который добавляют после Стерилизации в количеств.е 0,05 об. % Для выращивания -культуры используют ферментеры фирм LKB (Швеция) или B.Braun Melsunger (ФРГ), Культивирование проводят в непрерывно-проточном режиме по хёмостатному принципу. Для предотвращения вспенивания в среду добавляют силиконовое масло (0,01 %) , Подача среды осуществляется регулируемыми перистальтическими насосами. Коэффициент разбавления ,1-0,05 ч Аэрацию проводят воздухом из расчета один объем в минуту на один объем среды. Скорость вращения мешалки 400 об/мин. Температура среды культивирования . Значение рН среды поддерживают постоянным (6,0) при автоматической подаче И1елочи (0,5 % NaOH)-, Рост культуры измеряют по плотности суспензии. Выходящую из ферментера суспензию клеток охлаждают до 2°С и подвергают сепарирова ию на суперцентрифуге при 2800 об/мин, Отсепариро-. ванные клетки (20 г) суспендируют в 40 1Л 0,1.м фосфатного буфера. (KHjPO - NaOH, рИ-7,5), содержащего 1 мМ дитиотрейтола и разрушают на СР-дезинтеграторе (Швеция) при скорости вреицения мешалки 3000 об/мин в течение 25 мин, Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 4000 д, Супернатант разводят 0,02 М фосфатным буфером с дитиотрейтолом (1мМ) до 100 мл и используют для ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-г-целлюлозой, уравновешенной .тем же буфером. Элюирование проводят с помощью ступенчатого градиента, получаемого добавлением к исходному буферу NaCi, Препарат алкогольдегидЕхэззеназы элюируется 0,2 М NaCl, В результате ,ионооа 1енной хрсматографии на ДЕАЕ-целлюлозе получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз и обладающий высокой удельной активностью по метанолу (7100 нм/мг белка мин). П р .и -м ё р 2,Дрожжи Candida methyjica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01 об. %, После выделения фермента, осуществленного способом, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 1200 нм/мгбелка-мин. Пример 3.Дрожжи Candida methyAica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,1 об, %, После выделения фермента, осуществленного способом, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 500 нм/мг белка-мин.

предлагаемый способ позволяет получить НАД-эависимую алкогольдегидрогеназу с высокой метанолокисляющей активностью (в 15 раз выше, чем в известном способе), а также повысить эффективность процесса за счет применения проточных условий культивирования и использования нетоксичного этилового спирта как ,источника углерода.

Формула изобретения Способ получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы предусматривающий культивиррвание продуцирующих ее Дрожжей при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфата, минеральные соли и спирт в качестве источника

угледора, с последующим выделением

целевого продукта, о т л и чаю щ и и с я тем что, с целью повышения метанолокисляющей активности фермента, в качестве продуцента используют дрожжи Candida methyiica. У-670, а. культивирование ведут в проточных УСЛОВИЯХ, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентЕ ации 0,01-0,1 об. %.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Семискер Я.А., Микельсаар С.К., Хейнару Э,Х. СЯсислёние метанола НАДспецифичной дёгйдрогеназой метанол-. усваивающих дрожжей. - Микробиология., 19J1, т.46, ВЫП.1, с. 169-171. 2.Metra R.J. Pyridine NucleotideLinked:0xidation of methano L in metanol-assimifating yeastsr Journal of Bacteriology, 1975, 124, № 3, 1165-1Г67.

Похожие патенты SU763464A1

название год авторы номер документа
Способ получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы 1980
  • Егоров А.М.
  • Авилова Т.В.
  • Егорова О.А.
  • Платоненкова Л.С.
  • Егоров Н.С.
  • Березин И.В.
SU871525A1
СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МЕТАНОЛОКИСЛЯЩИХ БАКТЕРИЙ 1984
  • Диканская Э.М.
  • Куликова В.П.
  • Гетьман Н.А.
  • Калунянц Н.П.
  • Вольфович Д.И.
  • Фишер П.Н.
  • Федулова О.В.
RU1314667C
Способ культивирования микроорганизмов 1977
  • Рылкин Сергей Сергеевич
  • Шульга Анатолий Васильевич
  • Шкидченко Александр Николаевич
  • Орлова Валентина Сергеевна
SU767191A1
Способ получения кислотоустойчивых штаммов дрожжей 1983
  • Работнова Ирина Леонидовна
  • Андреева Елена Андреевна
SU1092175A1
Способ получения биомассы 1972
  • Троценко Юрий Александрович
  • Кирикова Наталья Николаевна
  • Быковская Светлана Витальевна
SU449933A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА 2020
  • Берков Андрей Дмитриевич
  • Коротовских Александр Петрович
  • Попов Алексей Юрьевич
  • Соломко Петр Иванович
  • Шулятьев Евгений Васильевич
RU2731517C1
Питательная среда для культивирования биомассы дрожжей и способ ее получения 2020
  • Берков Андрей Дмитриевич
  • Коротовских Александр Петрович
  • Попов Алексей Юрьевич
  • Соломко Петр Иванович
  • Шулятьев Евгений Васильевич
RU2742472C1
Штамм дрожжей Ogataea parapolymorpha ВКПМ Y-5081 - продуцент белковой биомассы 2023
  • Сафонов Александр Иванович
  • Орлянская Екатерина Владимировна
  • Киселева Лидия Викторовна
  • Тихонова Екатерина Николаевна
  • Гавриченко Никита Владимирович
RU2796923C1
Штамм дрожжей CaNDIDa ReQUINII - продуцент алкогольдегидрогеназы 1989
  • Замбржицкий Олег Николаевич
  • Коваленко Сергей Петрович
  • Будрис Марина Владимировна
SU1705338A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (2R, 3S)-ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ПОДСОЛНЕЧНОГО МАСЛА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA 2020
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Моргунов Игорь Григорьевич
  • Камзолова Светлана Владиславовна
  • Колин Дмитрий Александрович
RU2747583C1

Реферат патента 1980 года Способ получения над-зависимой алкогольдегидрогеназы

Формула изобретения SU 763 464 A1

SU 763 464 A1

Авторы

Егоров Алексей Михайлович

Авилова Татьяна Васильевна

Платоненкова Лидия Сергеевна

Егорова Ольга Айдиковна

Карзанов Владимир Васильевич

Егоров Николай Сергеевич

Березин Илья Васильевич

Даты

1980-09-15Публикация

1978-06-07Подача