Способ получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/04 

Изобретение относится к микробиологической промьпютенности, а именно к способам получения НЛД-зависимой формиатдегидрогеназы из дрожжей, и может найти применение в фармацевтической, медицинской промышленности, а также для научных исследований,

НАД-зависимая формиатдегидрогеназа катализирует окисление формиата до двуокиси углерода при сопряженном восстановлении НАД до НАДН. В связи с этим формиатдегидрогеназа может найти применение в окислительно-восстановительных процессах, связанных с регенерацией кофактора, например при модификации стероидов, получейии аминокислот, а также в биоэлектрохимических системах окисления органических соединений для создания топливных элементов, в которых НАДН выполнял бы функцию переносчика электронов с органических соединений на электрод.

Известны высокоочищенные препараты формиатдегидрогеназы, выделенные цэ 1eтaнoлйcпoлъзy oщиx дрожжей Kloeckera sp. 2201 Cl и метанолиспользующих грамотрицательных бактерий штамма № 1 2. Однако указанные высокоочищенные ферментные препараты обладают недостаточно высокой каталитической активностью. Кроме того, в качестве источника углерода в питательной среде для культивирования микроорганизмов-продуцентов используют метиловый спирт, что усложняет процесс наращивания биомассы и снижает его эффективность так как возникает необходимость очистки сточных вод.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу является способ получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, предусматривающий культивирование продулирующих ее дрожжей рода Candida при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2%-ный метиловый спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента Сз 1.Недостатками способа являются периодические условия культивирования, которые не позволяют поддерживать культуру в одном и том же физиологическом состоянии с высокой ферментативной активностью, а также недостаточно высокая активность фермента, составляющая 0,13 мкM/мин и белка для бесклеточного экстракта и 2,4 мкИ/минМГ белка для очищенного фермента.

Кроме того,, применение в качестве источника углерода метилового спирта усложняет культивирование в

производственных условиях, так как он летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола.

Цель изобретения - повышение ак5 тивяости целевого продукта и эффективности процесса.

Цель достигается тем, что в способе получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, предусматривающем

10 культивирование продуцирующих ее дрожжей рода Candida при аэрации на синтетической питательной среде, содержащий источники азота, фосфора, минеральные соли и спирт в качестве

5 источника углерода, с последующим выделением фермента, в качестве продуцента используют штамм дрожжей Candida methylica ИБФМ У-670, культивирование ведут в проточных услоQ ВИЯХ, в качестве источника углерода используют этиловый спирт и формиат натрия в концентрации 0,01-0,1 и 0,03-0,07% соответственно от объема питательной среды, при этом формиат

с натрия вносят в среду при достижении культурой экспоненциальной фазы .роста.

Повышение эффективности процесса происходит в результате культивирования в условиях протока, при

0 которых культура поддерживается в одной и той же фазе рйста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения высокой

5 формиатдегидрогеназной активности.

Проточное культивирование позволяет получать большие количества биомассы, чем периодическое, а использование в качестве источника

0 углерода этилового спирта вместо метилового значительно упрощает технологию, что также приводит к увеличению эффективности процесса.

Способ осуществляют следующим 5 рбразом.

Дрожжи Candida methylica ИБФМ y-67Q культивируют на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: (NH.).2i НРО 0,5;

. (N114) , 1,5; KNO, 4j MgS04 0,25 дрожжевой автолизат 0,01j этиловый спирт 0,01-0,1% по объему. Культивирование проводят в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавления 0,1 , при

5 рн 6,0. Формиат натрия в концентрации 0,03-0,07% вносят в среду через 6-8 ч от начала культивирования при достижении культурой экспоненциальной фазы роста.

0 Для выделения фермента биомассу разрушают на СР-дезинтеграте путем растирания со стеклянньми бусами .центрифугируют при 4 000 g в течение 1 ч. Надосадочную жидкость используют для выделения и очистки

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАД-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, предусматривающий культивирование продуцирующих ее дрожжей рода Candida при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и. спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и эффективности процесса, в качестве продуцента используют штамм дрожжей Candida methylica ИБ4Ф1 У-670, культивирование ведут в проточных условиях, а в качестве источ ника углерода используют этиловый 8 спирт и формиат натрия в концентрации 0,01-0,1 и 0,03-0,07% соответственно от объема питательной сре:ды, при этом фоЕмиат натрия вносят при достижении i культурой, экспонен циальной фазы роста. ро 1 О1 KD СЛ