Препарат для определения ферментативных свойств микробов "карандаш фермент Советский патент 1980 года по МПК C12K1/04 

1

Предложенное изобретение относится к области микробиологии и предназначено для ускоренного определения ферментативных свойств микробов при их идентификации,

Известны ускоренные методы определения ферментативных свойств микробов , например метод углеводных таб-. леток, содержащих сахара 1..

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является препарат, приготовленный из листа хроматографической бумаги в виде дисков, включающий углеводный субстрат, j феноловый красный и буферный раствор. Каждый диск площадью 1 см содержит 7 мг углевода и 0,1 мг фенолового красного и предназначен для определения ферментативной активности микро- 20 5ов один раз 2).

Для определения биохш.ических свойств микробов приготовляют смыв суточной культуры микробов со скошенного агара, которую в количестве25 1-2 мл добавляют к 15 мл расплавленного и охлг1жденного до мяройептонного arSpa и пробирке выливают в стерильную чашку Петри, После застывания накладывают 5-9 уг- 30

леводно-бумажных дисков на поверхность ivw СО-пептон но го агара и инкубируют в термостате при З7с,

Метод углазодно-бумажных дисков на там, что углевод и индикатор диффундируют в агаризованную питательную среду, засеянную млкробной культурой, в результате чего среда вокруг диска становится краской, В случае разложения углевода микробами до кислота через 3-5 ч вокруг диска меняется окраска среды; из красной она становится желтой, а при газообразовании в агаре образуются пузырьки с глзом и разрьюы среды.

Однако углеводно-бумажные диски не позволяют определять фермектатйвт ную активность непосредственно в микробной популяции без добавления питательной среды на стекле, пласомассе, фарфоре, бумаге. Кроме того, необходиь значительный расход углевода и индикатора на один анализ (7 мг углевода и 0,1 мг фенолового красного) . Методика исследований является достаточно трудоемкой: сначала заготавливают смесь микробной культуры и мясо-пеотонного агара, эат.;г.; накладьгоают на его поверхность углеводно-бумажные диски.

Целью изобретения является ускорение определения ферментативных свойств микробов и его удешевление без использования питательных сред и стерильных материалов.

Указанная цель достигается тем, что препарат дополнительно воск, пластилин, канифоль и ланолин. при следующем соотнсшении ингредиентов., вес. %:

Полученный препарат имеет форму карандаша по стеклу и обладает пишущими свойствами на.стекле, пластмассе, фарфоре, бумаге,Нанесение штриха на поверхность этих мао ериалов дает возможность использовать минимальное количество субсарата и индикатора рН {субстрата 0,1. мг и фенолового красного 0,01 мг), Необходимое для определения фер 1ентативной активности микробов при смешении с каплей смыва микробной культуры без использования питательных сред и стерил ьн ых t те ри ал ов .

На фиг,1 дана схема приготовления препарата для определения ферментативной активности микробов с глюкозой; на фиг,2 - методика постановки опыта с помощью препарата для определения фер лентативной активноети микробов; на фиг,2а - предметное стекло с нанесенными штрихами сахароз: Гл - глюкоза, Мт - маннит, Сх - сахароза; на фиг,26 - предметное стекло в чавже Петри: Гл - с культурой и покровным стеклом, Мт и Сх - с культурой; на фиг,2в - предметное стекло во влажной камере после инкубации в термостате: Гл - разложение с образованием кислоты и газа, Мт с образованием кислоты, Сх отсутствие ферментации,

В качестве ингредиентов использованы; ферментируемый субстрат,представ;1яющий собой , три-поли Саха РИДЫ, многоа томные спирты (глюкоза, арабиноза, галактоза, ксилоза, манноза, лактоза, сахароза, маннит и т.д.), химически чистые белые кристаллические порошки, которые используются для :изучения биохимической активности микробов;индикатор рН-феноловый красный водорастворимый индикатор в виде порошка коричневатого дзета {ТУ-6-09-3070-73); воск пчелиный в твердом состоянии желтого цвета, pacтвopи aлй в ЖИЕЯЫХ маслах,

Ш1.62-64°С; канифоль-хрупкое, стекловидное вещество светло-желтого цвета, плотностью 1,07-1,85 г/см, температура размягчения 52-70 с, хорошо растворима в эфире, спирте, 5 нерастворима в воде; пластилинпластическая масса из белой глины и пластифицирующих. вещеетв (МРТУ 6-15-394-69); ланолин - жироподобное вещество, предетавляюJQ щее собой смесь жиров и восков, содержащих холестерин, т.пл. 38-42 С ,фосфатный буферный раствор рН 8,0,

Пример, Приготовление и использование препарата,

В фарфоровую ступку №1 берут навески сахара -1 г и фенолового красного -0,1 г и растирают пестиком 5-10 мин, получают мелкодисперсную равномерно кирпичного цвета пудру. Затем к ней добавляют 1,0 мл фосфатнс го буферного раствора рН 8,0,раств6ряют при интенсивнрм растирании в течение 1-2 мин и получают смесь А. Параллельно ступку №2 помейдают над пламенем горелки, нагревают до 70-90° с и последовательно вносят, расплавляют и перемешивают: воск - 0,5 г, канифоль - 0,1 г, пластилин - 0,5 г, ланолин - 0,1 г. В результате получают однородную жидкую жиро-восковую смесь .Б . Смесь А вливают в горячую смесь Б и интенсивно растирают пестиком 3-5 мин до образования равномерно гомогенной вязкой карандашной массы.

Полученную карандашную массу вводят в стеклянную пресс-форму с бумажкой подложкой, диаметром 5-6 мм. Затем карандаш с бумажной оберткой вынимают из пресс-формы и оставляют при 18-25°С на 5 сут, для стабилизации его физико-химических свойств. После этого карандаш надписывают и используют для работы. Препарат для определения ферментативной активности микробов хранят при 18-25с неограниченно долго.

Для определения ферментативных свойств микробов (см,фиг, 2) на чистом, предметном стекле расчерчивают восковым карандашом жирным шрифтом 3-5 кружков, диаметром 1-1,5 см. Над каждым кружкрм-сокращенно надписывают вид сахара. Затем в каждом кружке делают штрих, нажимая на стекло и вращая в .руках КФ по вертикальной оси. Длина штриха 0,5-0,8 см и шириjKa О,,1-0,2 см. Например, в первом кружке - штрих КФ с арабинозой, во втором - с vlaннoзoй, в третьем - с ланнитом и т.д. Предметное стекло кладут внутрь чашки Петри, расположенной на столе. Сразу в каждый кружок на шрифт КФ наносят пипеткой по одной капле исследуемой культуры (cNeflB со скошенного агара в 1 мп фиэраствора концентрацией 5-10 млрд). Кладут влажную вату или фильтровальную бумагу, закрывают чашку и инкубируют в термостате при 31°С.

Определение газообразования производят на отдельном предметном стекле, каплю культуры на штрих КФ с глюкозой накрывают покровным стеклом, таким образом, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Учет результатов производят через интервал от 30 мин, до 5-7 ч. Если исследуемая культура расщепляет сахар с образованием -кислоты, то окраска капли переходит из красного в желтый цвет. При . газообразовании видно скопление пузырьков газа под покровным стеклом.

Препарат для определения ферментативной активности микробов - является экономичным, что определяется его низкой себестоимостью в силу и4пользования на один анализ начительно меньших количеств ингредиентов (0,1 мг сахара и 0,01 мг фенолового красного) , отсутствием необходимоетй применить питательные среды и стерилизовать используемые материалы; высокой скоростью анализа и простотой техники и малой трудоемкостью исполнения анализа.

Формула изобретения Препарат для определения ферментативных -свойств микробов, включающий

углеводный субстрат, феноловый красный, буферный раствор, отличающийся тем, что, с целькг ускорения определейия ферментативных сяойств микробов и его удешевления, он дополнительно содержит воск, пластилин, канифоль и ланолин при следующем соотношении ингредиентов, вес %:

.Источники информации, принятые во,внимание при экспертизе

1. Ленцнер А.А. О таблеточном методе определения биохимической активности микробов. - Лабораторное дело, т.10, 1961, с. 38-40..

2. Никитин В.М. и Пл5гару С, В. Ускоренное определение биохимических свойств микробов с помощью индикаторных бумажных дискЪв с углеводами. -:

Здравоохранение,1972, 1, с.52-54, (прототип).