Способ определения сахаролитической активности микробов Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/00 

4:

4

to

СП

;о

Изобретение относится к микробио- .логии и предназначено для определения сахаролитических свойств, микробов.

Целью изобретения является повыше- ние чувствительности способа,

Способ заключается в том, что на поверхность бумажного диска с полимерным покрытием размещают углеводные субстраты и индикатор в виде эн

зимоиндикаторных микропленок, которые дополнительно содержат гидролизат казеина сухой, а в качестве фиксирующего вещества - желатин при следующем соотношении компонентов, мас.%: углеводный субстрат 2-3; гидролизат казеина сухой 0,9-1,5; желатин 0,9- 1,5; феноловый красньш 0,01-0,025; фосфатньй буферный раствор рН 8,0 остальное.

Включенный в состав микропленки углеводньй субстрат используют в качестве ферментируемого субстрата, феноловый красный иг.рэет роль индикатоПример 1. Из бумаги .с поли мерным покрытием вьфезают диск диа метром чашки Петри и расчерчивают 20 квадратных зон площадью 1,5х х1,5 см.

В пробирку берут навеску соотве ствующего углеводного субстрата (0,25 г) и гидролизат казеина сухо (0,1 г) и к ним приливают растворы 10%-ного желатина 1,0 мл, 25%-ного фенолового красного 1,0 мл, фосфат го буферного рН 8,0-7,7 мл и раств ряют смесь на водяной бане при 90° получая субстратно-индикаторно-фик рующий раствор, который охлаждают

15

20

,ра рН реакции, осуществляемой сахаро-25 До комнатной температуры. Затем в

10

25492

крытием в виде капель объемом 0,02мл, которые высушивают до получения фиксированных энзимоиндикаторных микропленок. Для определения сахаролити- ческой активности микробов на энзи- моиндикаторные микропленки наносят по 1 капле исследуемой микробной культуры и термостатируют при 37°С.

Пример 1. Из бумаги .с полимерным покрытием вьфезают диск диаметром чашки Петри и расчерчивают 20 квадратных зон площадью 1,5х х1,5 см.

В пробирку берут навеску соответствующего углеводного субстрата (0,25 г) и гидролизат казеина сухой (0,1 г) и к ним приливают растворы 10%-ного желатина 1,0 мл, 25%-ного фенолового красного 1,0 мл, фосфатного буферного рН 8,0-7,7 мл и растворяют смесь на водяной бане при 90°С, получая субстратно-индикаторно-фикси- рующий раствор, который охлаждают

15

20

Изобретение относится к области микробиологии и предназначено для быстрого определения сахаролитической активности микробов при их идентификации. Для повышения чувствительности способа на поверхности бумажного диска с гидрофобным покрытием размещают углеводные субстраты и индикатор в виде фиксированных энзимо- индикаторных микропленок, содержащих дополнительно гидролизат казеина сухой и желатин при следующем -соотношении компонентов, мас.%: субстрат углеводный 2-3; гидролизат казеина сухой 0,9-1,5; желатин 0,9-1,5; феноловый красный 0,01-0,025; фосфатньй буферный раствор рН 8,0 остальное. 3 табл.Q «

литическими ферментами микробов при использовании ими углеводных субстратов. Желатин фиксирует на поверхнос ти бумажного диска с полимерной

пленкой субстраты и индикатор и вмес-зо значению углеводного субстрата и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания- капель и получения фиксированных энзимоиндикаторных микропленок.

Готовый диск с фиксированными микропленками хранят при комнатной температуре в бумажньпс пакетах в течение 3 лет (срок наблюдения). По мере надобности их используют для определе ;. ния сахаролитической активн э{И и микго- робов. С этой целью в крьшку чашки Петри кладут готовый диск и на знзи- моиндикаторные микропленки наносят пипеткой по 1 капле микробной взвеси, содержащей от 1 млрд. до 10 микробных клеток в 1 мл. Чашку закрывают и инкубируют при .

При расщеплении субстрата микробной культурой окраска капли переходит из красного цвета в желтьш.

те с гидролизатом казеина одновременно служат питательными веществами, за счет которых происходят рост, размножение микроорганизмов, сахаролитических ферментов и их определения. Это позволяет повысить чувствительность и ускорить определение, что приводит к быстрому накоплению сахаролитической активности микроорганизмов до 7 ч при концентрациях от 1 МЛРД.-1 млн. и до 18-24 ч при концентрациях до 10 микробных клеток в 1 мл.

Чувствительность и скорость определения сахаролитической активности микробов в предлагаемом и известном способах приведены в табл. 1.

Способ осуществляют следующим образом.

К навескам углеводородного субстрата и гидролизат казеина сухой приливают растворы желатина, фенолового красного и фосфатного буферного рН 8,0, затем растворяют смесь на водяной бане при 90° С и получают субст ратно-индикаторно-фиксирующий раствор. Полученный и охлажденный до комнатной температуры раствор наносят на поверхность диска с полимерным по35

40

45

50

55

Способ определения сахаролитической активности микробов осуществляют использованием энзимоиндикаторных микропленок, приготовленных из ингредиентов в пределах указанных граничных значений.

Примеры 2-9. Опыты проводят аналогично примеру 1.

центр каждой квадратной зоны диска наносят пипеткой по 1 капле объемом 0,02 мл субстратно-индикаторно-фикси- рующего раствора соответственно обо

Способ определения сахаролитической активности микробов осуществляют использованием энзимоиндикаторных микропленок, приготовленных из ингредиентов в пределах указанных граничных значений.

Примеры 2-9. Опыты проводят аналогично примеру 1.

Зависимость чувствительности способа от количественных соотношений компонентов энзимоиндикаторных микропленок показана в табл. 2.

Предлагаемы способ является более чувствительным, так как позволяет определить сахаролитическую активность микробов при концентрациях до 10 микробных клеток в 1 мл (табл,1). Это дает возможность изучить сахаролитическую активность микробной колонии, исключив этап накопления при выделении чистой культуры.

Сакаролитическая активность раз- личных микробов показана в табл.3.

Кроме того, способ позволяет конструировать целенаправленные микро- текстсистемы определения сахаролити- ческой активности различны;; групп микроорганизмов. .

Формула изобретения

Способ определения сахаролитичес- кой активности микробов, предусматКонцентрация.никробовJ в 1 ил

Скорость ферментации углеводных субстратов, ч,, по способу

- - - - -- + -f4- + ---.- + 1. + +

- - - + + + + + 4-.

+ ..+:.+

П-р м е ч а н и е: положительная реакция, - - отрицательная реакция.

. .

ривающий размещение исследуемого образца на бумажном диске с полимерной пленкой, приготовленной с использованием углеводных субстратов, индикатора - фенолового красного, фиксирующего вещества, растворенных в фосфатном буфере рН 8,0, с последующей оценкой результатов, отличаю- Q щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, для приготовления полимерной пленки дополнительно вводят гидролизат казеина сухой, а в качестве фиксирующего ве- 5 щества используют желатин при следующем соотношении компонентов, мае.%: Углеводньш субстрат

Гидролизат казеина сухой Желатин Феноловый красный

Фосфатный буфер- ньм раствор рН 8,0

От 2,0 до 3,0

0

От От

0,9 до 1,5 0,9 до 1,5

От 0,01 до 0,025

5

Остальное

Таблица 1

- + +

Прниечавие. Иитвисиваость реакция: + - редко положительвая (желтый цвет), + - положительная (саатло елтыв), + - спавополо«1П ельяая (орав- жевый), - - стрицательвая (краевые).

ТаблицаЗ

Escherichia coli 055 Shigella connei 1669 S.abortus bovis

S.sholerae suis S. typhimurium Citrobacter 117

Таблица2

0,0010,001

0,00250,0025

0,0050,005

0,010,01

&,02 0,02

0,025 0,025

0,030,03

0,050,05

+

+4-

++

+++

+-М-

0,075 . 0,075

+ +

+ + +

+

+ +

+ +