Способ диагностики альвеококкоза Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к области медицина, а именно диагностике паразитарных заболеваний.

Известен способ диагностики апьвеококкоза путем сенсибилизации эритроцитов антигеном, сведения их с испытуемой сывороткой с последующим учетом результатов их взаимодейтсвия.

Однако известный способ не обеспечивает вырокой чувствительности и специфичности диагностики.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики.

Это достигается тем, что эритроциты сенсибилизируют очищенным антигеном с молекулярным весом выше 600000, выделенным из гшьвеококка, и при положительной реакции в титре 160 и выше диагностируют альвеококкоз.

Способ осуществляют следующим об- .разом.

Цельный экстракт гомогенизированных ларвоцист альвеококка, выделенных от хлопковых крыс, наносят в ячейку с мембранным фильтром марки ХМ 100 дня отеделения и концент ро вания фракции с молекулярным весом

вьЕие 100000 от веществ с меньшим молекулярным весом. Фракцию с молекулярным весом выше 100000, составляю5 -ЩУЮ 80,2% белка цельного экстракта для дальнейшего разделения и концентрации диагностически ценных антигенов альвеококка,наносят затем на ячейку с мембраной марки ХМ 300. Фильтрация через мембрану позволяет получить в концентрате фракцию с молекулярным весом выше 300000, содержащую 28,2% белка цельного экстракта ларвоцист, включающую основные

с диагностически ценные антигены паразита, антитела к которым имеются у большинства больных альвеококкозом.

Для последующей очистки фракции о белков хозяина ее наносят на колонку с сефарочой 4В. Разделение ведут в 0,5% NaCe при скорости элюции 2,5 мл/чем. Пробы собирают на автоматический коллектор по 3 мл. По данTJHM иммунохимическрго анализа элюат делят на 4 подФракции.Две из них (1,2)содержат по одному антигену паразита, очищен ному по данным реакции ДВОЙНОЙ диффузии в геле (РДДГ),от бел ков хозяина.В состав третьей подфрак30 ДНИ входит 4 антигена паразита и 2 антигена хозяина,Четвертая подфракц входящая во внутреннем объеме колон представляет собой смесь антигенов п разита и хозяина с преимущественным содержанием последних. Первые три фракции содержат соответственно, %; 2; 3,51; 8,5 белка фракции концентр та ХМ 300, что составляет, 0,58; 1,0 2.4всего исходного белка цельного экстракта, в то время как в состав ч чет не ртой подфракции входит 86 % бел ка фракции или 24,2% цельного экстра та,что свидетельствует о значительно очистке трех первых подфракций и нев соком процентном содержании отдельны активных антигенов альвеококка в исх ном материале. Проведение реакции непрямой гемаг глютинации с очищенными антигенами альвеококка. Перед танизацией консервированные формалином эритроциты отмывают три раза (два раза физиологическим раствором и один раз буфером рН 7 , 2 при 2.5т об/мин 3-5 мин) . Состав буфера, мл; 0,15 М 72 0,15 М 28; 0,9% NaCi 900s Затем к 2,5% суспензии эритроцитов вливают 1:1 раствор танина в буфере (1:20000) и полученную смесь. инкубируют в термостате 20 мин при , После этого эритроциты отмываются три ,раза буфером при 2 т об/мин 3-5 мин и ресуспендируют в 2,5% концентрации в буфере Лиофилизированный порошок антиге нов альвеококка растворяют в буфере до концентрации белка, мг/мл; в I фракции во II фракции 0,19; в ill фракции 0.17, Танизированные эритроциты соединяют с равными объемами антигенов и полученные смеси оставляют на 20 кчи в термостате И 40 мин-при коглнатной температуре. Затем эритроциты, сенсибилизированные антигеном (диаг ностику1уи) , отмывают 3 раза,, ресуспендируют в превоначальном объеме ((2,5% суспензия), консервируют мерт латом (1:10.000 конечная концентрация) и оставляют в холодильнике до следующего дня. Приготовление сывороток для реак Все сыворотки (испытуемые, полож тельная контрольная сыворотка и нор мальная кроличья, на которой ставят реакцию, т.е. разводящая) инактивируют, т.е. выдерживают 30 мин в водяной бане при 56°С. После инактива ции сыворотки адсорбируют: к 1 мл сы воротки добавляют 0,2 мл отмытых ко сервированных эритроцитов и выдержи вают не менее двух часов„ Перед пос тановкой реакции HopMajiiJiyio ;-;роЛичью сыворотку разводят 1 : 10 г-г на ней готовят последовательно двукратные разведения испытуемых сывороток и контрольной положительной, начиная с ,1/20 и кончая 1/40.960 (12 разведе НИИ). Реакцию проводят в аглютинационных досках. Для испытания сыворотки с тремя .циагностикумами (I, II и III фракции) готовят четыре ряда (по 0,25 мл в каждой лунке) последовательных двукратных разведений. В первые три ряда закапывают диагностикумы по две капли в каждое разведение сыворотки, а в четвертый ряд - танизированные эритроциты (контроль сыворотки), Необходим также контроль диагностикумов: испытание их с разведениями заведомо положительной- сыворотки и больного альвеококкозом, и с разводящей сывороткой (3-4 лунки). Реакцию в зависимости от ее интенсивности оценивают по четырехплюсовой системе: ++++ - компактный клеточный агрегат; +++ - ровный слой клеток со складчатыми краями на дне лунки; ++ - ровный слой клеток, края местами зазубренные; + - темное узкое кольцо окружает края слоя клеток; +- - толстое темное кольцо окружает края слоя клеток, покрывающего малую поверхность; - плотный круглый осадок клеток, так называемая пуговка, За положительный результат принимали положительную реакцию не менее, чем на три креста с титром :сыворотки. 160, принятом за диагностический. Определение сравнительной активносrpj диагностикумов из очищенных антигенов альвеококка и из цельного антигена эхинококка (жидкости ларвоцист) показало преимущество для диагностики гомологичных антигенов (табл,1). Положительная реакция в ,диагностическом титре и выше наблюдалась с диагностикумом из I фракции у 88,8% сывороток больных альвеококкозом, из II фракции - с 88,6% сывороток больныХр из III фракции - с 92,3%, в то время как с диагностикумом из цельного антигена эхинококка реакция была положительна всего лишь с 80,9% сывороток больных альвеококкозом (табл„ 1), Вариабельность иммунного ответа при данном гельминтозе требует использования в диагностике и соответствующего набора антигенов. Поэтому одновременное использование трех очищенных антигенов позволяет еще больше повысить чувствительность реакции, так как сыворотки больных альвеококкозом, давшие отрицательный результат с одними антигенами, были положительны с другими. Сравнительные анализы активности РИГА с очищенными антигенами альвеококка и цельным антигеном (жидкость ларвоцист).эхинококка приведены в табл . 1 и 2 . .

Таблица 1,

Таблица 2.