Способ получения рибонуклеазы Советский патент 1981 года по МПК C12D13/10 

Клетки поверхностной культуры сое динены в длинные филаменты, при глубинном культивировании встречаются как одиночные клетки, так и соединен ные попарно или по четыре. Размер клеток: диаметр О ,6-0 ,7ум, ,длина 1,5 . Диаметр спор не превышает д аметра клетки, споры расположены экс центрально, но ближе к центру, чем резко отличаются от спор многих других штаммов того же вида, имеющих ви спичечной головки . Физиолого-биохимические свойства Молоко пептонизирует без подкисления. Желатину разжижает. Казеин и крахмал гидролизует. Отношение к углеводам: арабинозу галактозу, клюкозу, ксилозу,рамнозу дульцит, маннит, сорбит, мальтозу, лактозу, сахарозу, декстрины, крахмал ассимилирует без предпочтения. Нитраты восстанавливает. На среде Кларка образует ацетилметил карбинол . Хорошо растет при 25-42°С, оптимальная температура роста . Культура является аэробом, в отсутствии кислорода подвергается анаэробному лизису . При глубийном культивировании на питательных средах, содержащих органические источники углерода, азота и минеральные соли, штамм синтезирует следующие ферменты: комплекс бактериолитических ферментов, р глюканазу, маннаназу, хитиназу, нейт ральную протеазу, РНКазу, сС-амилазу каталазу. Пример 1. 120 г картофельного крахмала,суспендируют в 500 мл водопроводной воды, добавляют 0,2 г амилосубти ина ГЗХ и нагревают взвес при постоянном перемешивании до периодически проверяя реакцию крахмала с йодом. Осахаривание заканчивают по достижении красно-коричневой окраски. В 500 мл водопроводной воды растворяют 0,3 г калия сернокислого и 0,01 г сернокислого цинка, добавляют 15 г сухого ферментативного гидролизата биомассы метанокисляющих бактерий .тщательно ,размешивают полученную взвесь, затем добавляют раствор осахаренного крахмала, вновь перемешивают среду и устанавливают рН 6,8 с помощью 10% раствора NaOH. Питательную среду разливают по 100мл в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют в течение часа при давлении 0,5ат После охлаждения среду засевают водной суспензией поверхностной куль туры В. Bubtit-is В-1611, вь1ращенной на ломтях картофеля в течение суток при 37С. Колбы с засеянной средой инкубиру ют на качалке при в течение 20ч по.окончании инкубации рН культураль ной жидкости 4,6 активность рН Казн 5200 ед/мл. Активность фермента сохранялась в течение 10 дней при хранении культуральной жидкости при температуре 5°С. Пример 2 . /В чан,оборудованный мешалкой и водяной рубашкой, наливают 75 л водопроводной воды и при перемешивании добавляют 18 кг картофельного крахмала и 60 г амилосубтилина ГЗХ. Суспензию крахмала нагревают при перемешивании до 75°С и выдерживают при этой температуре 10 мин до момента перехода крахмала в эритродекстрины. Раствор осахаренного крахмала передают в ферментер емкостью 250 мл вносят 0,2 л подсолнечного масла в качестве пеногасителя и стерилизуют компонент 30 мин при 135с. В чан с мешалкой наливают 45 л водопроводной воды, вносят 2 кг сухого ферментативного гидролизата БВК, 0,045 кг КСЕ и 0,0015кг сернокислого цинка, тщательно размешивают ; взвесь и передают в сателлит ферментера. (Стерилизуют 30 мин при 135°С. После охлаждения до содержимое сателлита передают в ферментер, среду охлаждают до температ фы , устанавливают рН 7 с помощью водного аммиака. Питательную среду засевали водной суспензией культуры В.subtitle В-1611, выращенной в колбе на пшеничных отрубях в течение 2 сут при . Выращивание в ферментере проводят при 37 ± 1°С, постоянном перемешивание и аэрации 8-10 , продолжительность выращивания 18 ч. В процессе выращивания рН культуральной жидкости не регулируют. По окончании процесса рН культуральной жидкости составляет 4,3, активность рН Казы 6800 ед/мл, объем культуральной жидкости 150 л. Активность рН Казы в культуральной жидкости оставалась постоянной в течение 7 дней при 5Предлагаемый способ получения рибонуклеазн позволяет увеличить активность фермента в культуральной жидкости до 5200-6800 ед/мл, что в 3 раза выше по .сравнению с известным способом при одновременном сокращении продолжительности выращивания продуцента. « Формула изобретения 1, Способ получения рибонуклеазы., предусматривающий культивирование ее продуцента - бактерий вида Вас 1 lus 5иЪЪ1Е1в на питательной среде, содерЖсццей источники азота, фосфора, минеральные соли и крахмал в качестве источника углерода, отличающ и и с я тем,что,с целью повышения активности фермента и сокращения времени культивирования,в качестве продуцента рибонуклеазы. из вида BaciE.-

Eu5 subtitle используют штамм Ъак л E-US c,.i5ЦМПМ В-1611.

2. Способ по п. 1,отлича ющ и и с я тем, что культивирование продуцента осуществляют на питательной среде следующего состава, г/л:

Крахмал картофельный

осахаренный100-140

Гидролизат микробной

13-17 0,27-0,33 0,009-0,011 Остальное

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l.NisVtimura S.Bacittus t-ibonucbease Proceedings in nucteic acid re5eqrc1i Ne w jork-l.ohdott,1966.56-63.