Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS - продуцент рестриктазы изошизомера Советский патент 1990 года по МПК C12N9/22 C12N9/14 

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм В. thurin- giensis, продуцирующий эндонуклеазу (рестриктазу), названную Btu-I и узнающую последовательность нуклеотидов 5 -ATCGAT-З .

Рестриктаза Btu может быть использована при исследовании первичной структуры ДНК и в генной инженерии при конструировании рекомбинантных

ДНК.

Целью изобретения является создание высокопродуктивного штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 - продуцента рестриктазы Btu-I изоши- зомера С1а I, продуцирующего только одну рестриктазу.

Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) позволяет получить рестриктазу Btu-I ияошизомер Cla I

в количестве до 5000 ед./г сырой биомассы. Предлагаемый штамм хорошо растет на питательной среде простого состава и продуцирует одну рестриктазу, что значительно упрощает ее выделение.

Предлагаемый штамм В.thuringiensis ВКПМ В-4287 (ВНИИ генетики 16-И-48) выделен из природного материала в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаэы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов.

Исследуемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими

признаками.

Морфологические признаки: грамм- положительные палочки, перетрихи размером (1,5-1,9)«(3-6) мкм, образует

(/

С

ел

Јъ Ј 00 О ГО

10

поры и вытянутые мелкие ромбовидые кристаллы.

Культуральные признаки: на агари- зованной среде Хоттингера через 24 ч роста при 30°С гатамм В. thurin- iensis (ВНИИ генетики 16-И-48) образует шероховатые колонии с серым тливом, края ровные, центр более лотный, возвышается в виде пуговки, вокруг которой четко виден ваик, d 3-10 мм.

О

На среде МПА через 24 ч при 30 С бразует колонии с ровными краями, . поверхность шероховатая, в центре е|цва заметное возвышение, по краю валик, d 3-8 мм.

На дрожже-полисахаридной среде 100 г сорбита, 60 мл дрожжевого автолиз эта, 1 г (NH4)S04, pH 5,8, 20 г агара на 1 л среды штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) образует колонии плоские, с несколько различными краями, центр более плотный, блестящий, d 3-8 мм.

Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Штамм В. thuringiensis сбраживает глюкозу, сахарозу. Не использует маннозу, салицин, эскулин. Образует TWE (TW-эстеразу), не образует лецитин.

Отношение к источникам азота„ Усваивает аминный азот белков.

Отношение к температуре: растет от 28-37°С, оптимум 30°С.

Отношение к рН среды: растет При рН от 5,8-7,2, оптимум рН 7,,0.

Отношение к кислороду: аэроб,, Щтамм не патогенен. Культура хранится на агаризованной среде Хоттингера под вазелиновым маслом.

Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) продуцирует рестрик- тазу со специфичностью 5 ATCGAT,, названную Bru-I, согласно общепризнанной номенклатуре. Рестриктаза Btu-I чувствительна к метилированию внутреннего аденинового основания в сайте узнавания.

Оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8,0, оптимальная температура действия рестриктазы 37-40 С, для активности Фермента требуются ионы Mg24(5-10 мМ) „ Фермент активизируется небольшими концентраци- ими NaCl (25-50 MF). За единицу ак- ивности принимается количество фер- чента, вызывающее полное расщепление

15

2

2

5

0

5

1 мкг ДНК cbara лямбда за 1 ч инкубации при 37°С. Состав буфера: 10 мМ трис-HCl, 50 мК NaCl, 10 мМ MgCl, 0 мМ 2-МЭ, рН 7,5. Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемых рестриктазой Btu-I, проводили гидролиз ею ДНК различного происхождения, для которой известна нукле- отидная последовательность: бактериофага лямбда ( Л ), ф XI 74 РФ, Ml 3, вируса SV 40, плазмиды РВР322.. Расщепление ДНК проводят в реакционной среде следующего состава: 10 мМ трис- HCl (рН 7,5) 6 мМ 2-мерпатоэтанола, 6 мМ MgCl2 и 50 мМ NaCl при 37°С. Количество фрагментов, полученных при расщеплении различных ДНК рестриктазой Btu-I позволяет однозначно установить сайт узнавания - 5 ATCGAT (Gene, 10, 357, 1980).

Количество сайтов расщепления для рестриктазы Btu-I и С1а на ДНК различного происхождения приведено в таблице.

5

0

5

0

5

Таким образом, рестриктаза Btu является изошизомером ранее описанной и широко используемой в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии рестриктазы Cla I. Рестриктаза Btu-I по характеру своего действия аналогично рестриктаэе Cla Т чувствительна к dam-метилированию.

Пример. Штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) поддерживают в пробирках на агаризованной среде Хоттингера под вазелиновым маслом. Для оживления штамм пересевают на агар Хоттингера и инкубируют при 37°С 19 ч Затем пересевают в пробирки с 5 мл бульона Хоттингера и инкубируют при 37°С 4 ч на качалке. Такую культуральную жидкость вносят в соотношении 1:50 в 250 мл бульона Хоттингера в колбы объемом 650 мл и выращивают на круговой качалке при 250 об/мин при 37 С до поздней логарифмической фазы (19 ч). Культуральную жидкость охлаждают до 4°С и центрифугируют на центрифуге Sorval-3c при 6000 об/Мин 30 мин. Выход сырой

биомассы 5 г с 1 л купьтуральной жид- кости. Биомассу хранят при -20°С.

Для выделения фермента 1 г биомассы суспендируют в 6 мл буфера А (20 мМ трис-HCl; рН 7,5; 10 мМ 2-мер- каптоэтанола, 0,1 мМ ЭДТА, 5% глицерина), обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 50 W в течение

15

20

8 мин и центрифугирую при 18000 об/мин, ю 4000 ед./мл. Препарат фермента хра- 60 мин. Полученный басклеточный экстракт со скоростью 1 мл/мин наносят на колонку размером 1,51 1,9 см с ДЭАЭ-трисакрилом (ДЕАЕ-Trisacrylm LKB, уравновешенную буфером А и подсоединенную к системе FPLC фирмы Pharmacia (Швеция).

Колонку промывают тем же буфером и элюируют градиентом NaCl 0-0,5 М в буфере А. Общий объем градиента 35 мл. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,06-0,09 М NaCl, объединяют, диализуют против буфера А и наносят на колонку Моно Q HR 5/5 (Pharmacia), уравновешенную буфером А. Элюируют градиентом NaCl (0- 0,5 М) в буфере А. Общий объем градиента 20 мл. Наиболее активные фракции, элюируемые при 0,2-0,25 М NaCl, объединяют, диализуют против буфера В (60 мМ КР04; рН 7,4; 10 мМ 2-мерпатоэтанола; О,1 мМ ЭДТА; 5% глицерина) и наносят на колонку Моно S HR 5/5 (Pharmacia), уравновешеннят при -20°С. Выход фермента соста ляет 5000 ед./г сырой биомассы.

Таким образом, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом: не требует для культивирова ния сложной питательной среды и превосходит его по продуктивности в 10 раз (5000 ед./г сырой биомассы против 450 ед./г сырой биомассы).

Кроме того, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) хорошо растет на простой питательной среде и обладает коротки временем культивирования: за 19 ч накапливает 5 г сырой биомассы/л культуральной жидкости.

30 Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 - продуцент рестри тазы Btu-I изошиэомера С1а I.

25

ную буфером В. Элюируют градиентом NaCl (0-0,5 К) в буфере В. Общий объем градиента 20 мл. Наиболее активные фракции,.элюируемые при 0,32- 0,38 М NaCl, концентрируют диализом против буфера В с 50% глицерина и 50 мК NaCl. Получают 1,25 мл препарата рестриктазы Btu-I с активностью

4000 ед./мл. Препарат фермента хра-

нят при -20°С. Выход фермента составляет 5000 ед./г сырой биомассы.

Таким образом, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) обладает следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом: не требует для культивирования сложной питательной среды и превосходит его по продуктивности в 10 раз (5000 ед./г сырой биомассы против 450 ед./г сырой биомассы).

Кроме того, предлагаемый штамм В. thuringiensis (ВНИИ генетики 16-И-48) хорошо растет на простой питательной среде и обладает коротким временем культивирования: за 19 ч накапливает 5 г сырой биомассы/л культуральной жидкости.

30 Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-4287 - продуцент рестриктазы Btu-I изошиэомера С1а I.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм BACILLUS THURINGIENSIS ВКПМ В-4287, продуцирующий рестриктазу, названную BTU-1 и узнающую последовательность нуклеотидов 5 @ - ATCGAT-3 @ . Штамм выделен из природного материала в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктазы путем оценки эффективности посева различных бактериофагов. Штамм хорошо растет на простой по составу питательной среде и выделяет только одну рестриктазу, что значительно упрощает ее выделение. Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы. 1 табл.