Питательная среда для культивирования метанотрофных бактерий Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно: к способу культивирования метанотрофных бактерий, который может быть использован для получения микробиологического белка, для кормления животных.

На сегодняшний день в России дефицит кормового белка составляет более 2,5 млн т в год. По данным Минсельхоза России за 2018 год производство белковых кормов в России составило 11,8 млн. тонн, что удовлетворят потребность сельскохозяйственных предприятий только на 70%, поэтому спрос на белковые корма продолжает расти. Недостаточное количество белка в рационе сельскохозяйственных животных приводит к снижению их продуктивности и увеличению риска болезней. Одним из перспективных путей решения данной проблемы является использование метанотрофных бактерий, продуцирующих микробиологический белок. Метанотрофные бактерии в оптимальных условиях активно перерабатывают одноуглеродные соединения (метан, метанол и др.), быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и другими биологически активными веществами.

Известны различные штаммы метанотрофных бактерий, продуцирующие кормовой микробиологический белок, например, штаммы видов Pseudomonas methanica, Methylococcus capsulatus, Methylocystis parvus, Methylosinus sporium, Methylosinus trichospohum, Methylobacter acidophilus, Methylomonas rubra, Methylococcus sp., Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus, Methylomonas methanica, Methylomonas agile. Штаммы этих видов характеризуются различными скоростями роста и выходом биомассы. В качестве потенциальных продуцентов микробиологической биомассы мы использовали штамм Methylomonas methanica B-2110 и штамм Methylococcus capsulatus B-2990, так как эти штаммы сохраняют способность окислять метан после культивирования на питательной среде с метанолом.

Наиболее близким аналогом является способ культивирования штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 в питательной среде, содержащей следующие минеральные компоненты (на 1 литр среды): (NH₄)₂SO₄ - 0,56 г; MgSO₄⋅7H₂O - 0,02 г; KCl - 0,025 г; (NH₄)HPO₄- 0,04 г; (NH₄)H₂PO₄- 0,04 г; ZnSO₄⋅7H₂O - 0,3 мг; MnSO₄⋅5H₂O - 0,54 мг; CuSO₄⋅5H₂O - 0,54 мг; H₃BO₃- 0,6 мг; FeSO₄⋅7H₂O - 2,0 мг; Na₂MoO₄⋅2H₂O - 0,045 мг; CoSO₄⋅7H₂O - 0,048 мг; Трилон Б - 5,0 мг; рН среды 5,6-5,8 (патент RU 2 728 345 C1). Но в данном составе отсутствует CaCl₂, который является стимулятором роста метанотрофов и стабилизирует кислотность питательной среды.

Также существует способ культивирования метанотрофных бактерий, в минеральную питательную среду дополнительно вводится угольная кислота в виде бикарбоната натрия или углекислого газа. Питательная среда имеет следующий состав (г/л): CH₃OH -1,4 мл; NaHCO₃- 1,4 г; KNO₃- 1,0 г; NaHPO₄- 1,5 г; MgSO₄- 0,2 г; CaCl₂ - 0,02 г; Трилон Б - 0,05 мг; FeSO₄⋅7 H₂O - 0,002 г/л; H₃BO₃ - 0,3 мг; MnCl₂⋅4 H₂O - 0,03 мг/л; CoCl₂⋅6 H₂O - 0,2 мг/л; ZnSO₄⋅7 H₂O - 0,1 мг/л; Na₂MoO₄ - 0,03 мг/л; NiCl₂⋅6 H₂O - 0,02 мг/л; CuCl₂⋅2 H₂O - 0,01 мг/л, рН среды 6,8 (патент SU770174A1). Но недостатком данного способа является то, что угольная кислота распадается на углекислый газ и воду, а в процессе жизнедеятельности бактерий также выделяется углекислый газ, известно, что избыток CO₂ приводит к ингибированию роста и развития бактериальных клеток.

Цель изобретения - увеличить скорость роста колоний метанотрофных бактерий при культивировании на твердой питательной среде (на примере штаммов Methylomonas methanica B-2110 и Methylococcus capsulatusB-2990) путем добавления к питательной среде № 221 0,01% CaCl₂. Преимущество экспериментальной питательной среды состоит в том, что она способствует более эффективному росту штаммов метанотрофных бактерий за счет количества CaCl₂, обеспечивающего наилучший рост и развитие колоний штаммов метанотрофных бактерий.

Чтобы приготовить питательную среду для культивирования метанотрофных бактерий предварительно растворяли каждый компонент в дистиллированной воде, смешивали, добавляли 10 г/л агар-агара, разогревали на водяной бане до полного растворения агар-агара. Полученную питательную среду разливали в пробирки и стерилизовали в автоклаве при давлении 1,2 атм. в течение 45 мин., стерильный метанол вносили пипеткой в пробирки с питательной средой после стерилизации. Посев чистых культур микроорганизмов проводили в ламинарном боксе LORICA БАВнп-01-«Ламинар-С»-1,2. пробирки инокулировали 7-ми суточными штаммами Methylomonas methanica B-2110 и Methylococcus capsulatus B-2990. Далее пробирки помещали в вакуумный эксикатор. С помощью вакуумного насоса DSZH WK-115N откачивали воздух из эксикатора, что обеспечивало создание анаэробных условий. Затем эксикатор с пробирками помещали в термостат ТС-1/20, где инкубировали пробирки 21 сутки, штамм Methylomonas methanica B-2110 при температуре 30°C и штамм Methylococcus capsulatus B-2990 при температуре 37°C. Рост колоний оценивали визуально. На плотных средах образовывались кремовые и розовые ослизненные колонии. Рост колоний измеряли под микроскопом при помощи окуляр-микрометра. Замеры производили на 7-е, 14-е и 21-е сутки. Результаты представлены в табл.1, 2.

Таблица 1. Рост штамма Methylomonas methanica B-2110 на твердой питательной среде № 221 с разными концентрациями CaCl₂. № W_CaCl2, % 7 сутки, мм 14 сутки, мм 21 сутки, мм % к контролю 1 0,02 (контроль) 1,4 ± 0,12 3,1 ± 0,22 4,7 ± 0,41 55 2 0,002 (эталон) 3,0 ± 0,27 5,1 ± 0,48 8,7 ± 0,78 100 3 0,01 3,7 ± 0,28 6,9 ± 0,58 10,5 ± 0,89 125 4 0,001 1,7 ± 0,16 3,7 ± 0,34 5,6 ± 0,64 65

Сравнительный анализ роста колоний при разных концентрациях CaCl₂ показал, что при добавлении 0,01% хлористого кальция рост штамма Methylomonas methanica B-2110 был на 25% выше, чем в контрольном варианте.

Таблица 2. Рост штамма Methylococcus capsulatusB-2990 на твердой питательной среде № 221 с разными концентрациями CaCl₂. № W_CaCl2, % 7 сутки, мм 14 сутки, мм 21 сутки, мм % к контролю 1 0,02 (контроль) 1,5 ± 0,11 2,8 ± 0,14 3,9 ± 0,31 53 2 0,002 (эталон) 2,7 ± 0,17 4,9 ± 0,42 7,8 ± 0,71 100 3 0,01 3,0 ± 0,22 5,7 ± 0,45 9,4 ± 0,87 117,5 4 0,001 1,6 ± 0,12 3,1 ± 0,23 4,7 ± 0,37 61

Рост штамма Methylococcus capsulatus B-2990 при добавлении 0,01% CaCl₂ был выше на 17,5%, чем в контрольном варианте.

Таким образом, результаты исследования показали, что наилучшей для роста колоний исследованных штаммов концентрацией CaCl₂ в питательной среде является 0,01%. Использование данной концентрации способствовало активному росту и развитию бактериальных колоний.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой твердую питательную среду для культивирования метанотрофных бактерий, содержащую источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол (CH₃OH) в качестве единственного источника углерода и энергии, при этом для ускорения роста и увеличения активности бактериальных колоний в питательную среду добавляли 0,01% CaCl₂, что соответствует 0,1 г на 1 л среды. Изобретение позволяет увеличить скорость роста колоний метанотрофных бактерий. 2 табл.

Твердая питательная среда для культивирования метанотрофных бактерий, содержащая источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол (CH₃OH) в качестве единственного источника углерода и энергии, отличающаяся тем, что для ускорения роста и увеличения активности бактериальных колоний в питательную среду добавляли 0,01% CaCl₂, что соответствует 0,1 г на 1 л среды.