Штамм микроскопического гриба ASpeRGILLUS теRRеUS - продуцент фосфопротеин фосфатазы Советский патент 1990 года по МПК C12N1/14 C12N9/16 

Изобретение относится к ферментной микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм микроскопического гриба, который может быть использован для получения фермента фосфопротеин фосфатазы, применяемого в пищевой промышленности и как полуфабрикат в клинической и экспериментальной медицине и фармакологической промышленности, а также препаративной биохимии.

Целью изобретения является выделение штамма микроскопического гриба, обладающего способностью к биосинтезу фосфопротеин фосфатазы в погруженной культуре и замена источников сырья

животного происхождения на микробиологическое.

Штамм микроскопического гриба Aspergillus terreus выделен из почв степного участка Приокского террасного заповедника. Предлагаемый штамм Aspergillus terreus ВКПМ F-394 получен путем рассева и является монокони- диальным вариантом исходной культуры.

Культивирование Aspprgillus terreus шт,87-19 проводили глубинным способом на питательной среде, содержащей углеводы, минеральный и органический азот и микроэлементы. Выращивание осуществляли в течение 66-72 ч при . Культуральную жидкость отдеел

С71

ОС

к

ляли от мицелия с помощью фильтрования. Фильтрат высушивали лиофильно.

За единицу активности фосфопротеин фосфатазы принимали такое количество фермента, при действии которого на субстрат в стандартных условиях образуется 1 мкмоль фосфора.

Активность фосфопротеин фосфатазы в культуральной жидкости 620-690 ед/мл удельная активность фермента в препарате 180-197 ед/мг белка.

Морфологические признаки. Мицелий, выращенный на агаризованной среде Чапека-Докса, имеет в диаметре 2-3 мкм слабосептированный, мелкозернистый. Конидиеносцы длинные ф 4,8-7,А мкм, конидиальные головки большей частью не радиального строения, стеригмы двурядные, конидии в цепочках, на

вершине конидиалъной головки образуют хохолок. Головка конидиеносца в 0 17,6-12,4 мкм, конидии в 0 2,2-2,5 мкм поверхность гладкая. Колония к 4-м суткам при 30°С быстро растет и до- стигает в 0 27-30 мм, приподнята над субстратом, бежевого цвета, кольцеобразно имеющего разные оттенки, сильная радиальная складчатость. С обратной стороны колония белая с лимонно- желтой пигментацией, сильная радиальная складчатость. Интенсивное споро- ношение начинается на 4-5-е сутки ро с т а.

Культуральные признаки. На синтетической агаризованной среде Чапека культура при 30°С растет быстро, колонии через 24 ч роста имеют в диаметре 2-3 мм. Мицелий белый, пушистый. Через 48 ч роста диаметр колонии

достигает 20 мм. Мицелий сильно приподнят над субстратом. Центр колонии имеет кратерообразную вершину слабопалевого цвета. Остальная часть колонии белоснежная, края неровные, бес- цветные. С обратной стороны колония складчатая, в центре светло-желтая, к краю бежевая, сам край бесцветный. На 3-й сутки диаметр колонии достигает мм. Центральная часть колонии сильно поднята над субстратом, морщинистая, светло-желтого цвета, напоминает плато диаметром 17 мм. Вокруг плато кольцом белая, пушистая культура с зубчатыми краями, слегка морщинистая, шириной 3-4 мм, затем бесцветная полоса культуры шириной 2-3 мм с неровными краями. Обратная сторона колонии: центральная часть

о

,,

5

0

5

складчато-морщинистая, желтого цвета, остальная часть - колонии слабо-бежевая, сильная складчатость. На 4-е сутки роста никаких культуральных изменений не произошло.

При 40 С на той же среде через 24 ч роста колонии достигают в диаметре 5 мм. Белый, пушистый мицелий слегка приподнят над субстратом. Через 48 ч роста диаметр колонии достигает 50- 52 мм. Колония сильно приподнята над субстратом, ярко выраженная радиальная складчатость, вершина кратерооб- разная. Внутри кратера светло-желтая окраска, по краю кратер бежевый, остальная часть колонии белая или светло-палевая. С обратной стороны колония радиально крупноскладчатая в диаметре 10-12 мм с желтой пигментацией, по краям - палевая; края колонии неровные, колония плотная, войлочная.

На 3-й сутки роста диаметр колонии 37-38 мм, колония приподнята над субстратом; центральная часть светло- бежевого цвета с обильным количеством конидий, затем идет зона шириной

2мм светло-палевого цвета, переходящая в зону белого цвета, край бесцветный, неровный, сильная радиальная складчатость. Обратная сторона колонии более менее равномерного лимонного цвета с переходом в белый по краям колонии, сильная радиальная складчатость.

На 4-е сутки роста диаметр колонии достигает 44-52 мм. Приподнятость колонии над субстратом исчезла. Радиальная складчатость еще более усилилась. Центр колонии темно-бежевый. Окраска колонии меняется кольцеобразно: центр диаметром 15 мм темно-бежевый, первое кольцо толщиной 7 мм равномерно светло-бежевое, второе кольцо толщиной 7 мм равномерно светло-бежевое, второе кольцо толщиной

3мм желто-бежевое, третье кольцо толщиной 4 мм светло-бурого цвета, четвертое кольцо толщиной 3 мм белого цвета.

В последующие 10 сут характер колоний не изменился.

При углубленном культивировании на сусле 8°Б через 20-24 ч роста при температуре в интервале 30-40 0 обнаружены клетки типа экзоспор, шаровидной формы с четкой оболочкой диаметром 3-6 мм, которые не исчезли в процессе культивирования. При глубинном культивировании культура склонна к образованию пиллет.

Отношение к углеродному питанию: ассимилирует крахмал, глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, галактозу.

Отношение к азотному питанию: растет на нитратах, аммонийных неорганических солях, органических источника азота.

Отношение к кислороду: облигатный аэроб.

Отношение к температуре: термото- лерант, температурный оптимум роста 3 0-40вС.

Отношение к кислотности среды: растет при рН 3,0-7,0, рН оптимум 3,5-6,0.

П р и м е р. В колбу емкостью 750 мл наливают 100 мл питательной среды следующего состава, %: крахмал кукурузный 3; ПВК 0,15; MgS04 0,1; КС1 0,1; ЫН4Шг 0,1; (NH4)2S04 0,1; NaCl 0,3; вода - остальное.

Затем засевают конидиальной суспезией A.terreus шт.87-19. Культивирование проводят при 35 С, в условиях аэрации на качалке при 180 об/мин в течение 72 ч. Активность фермента фосфопротеин фосфатазы 689,8 ед/мл.

5

Таким ооразом, выделенный штамм обладает способностью синтезировать фосфоиротенн фосфатаэу (К.Ф.3.1.3.16), образование которой ранее не отмечалось у микроорганизмов. Гриб A.terreus шт.87-19 представляет собой новую культуру со стойкими морфологическими и биохимическими признаками и свойствами.

Использование предлагаемого штамма дает возможность получать новый фермент фосфопротеин фосфатазу для технической микробиологии. Микроорганизм является облигатным аэробом, термотолерантом с короткой лаг-фазой, быстрым эакислением культуральной жидкости (24 ч рН 3,5 при исходном рН среды 6,7), что предохраняет его при культивировании от бактериальной инфекции. Склонность к образованию пиллет ускоряет процесс отделения биомассы от культуральной жидкости.

Весь этот комплекс свойств делает 5 микроорганизм очень технологичным.

Формула изобретения

0

Штамм микроскопического гриба 30 Aspergillus terreus ВКПМ F-394 - продуцент фосфопротеин фосфатазы.

Изобретение относится к ферментной отрасли биотехнологии и может быть использован для получения фермента фосфопротеин фосфатазы, применяемого в пищевой промышленности и как полуфабрикат в клинической и экспериментальной медицине и фармакологической промышленности, а также препаративной биохимии. Цель изобретения - выделение штамма микроскопического гриба, обладающего способностью к биосинтезу фосфопротеин фосфатазы в погруженной культуре и замена источников сырья животного происхождения на микробиологическое. Штамм ASPERGILLUS TERREUS ВКПМ F-394 получен путем рассева и является моноконидиальным вариантом исходной культуры. Штамм является облигатным аэробом, термотолерантом с короткой лаг-фазой, быстрым закислением культуральной жидкости (24 ч PH 3,5 при исходной PH среды 6,7), что предохраняет его при культивировании от бактериальной инфекции. Активность фосфопротеин фосфатазы в культуральной жидкости 620-690 ед/мл, удельная активность фермента в препарате 180-197 ед/мг белка.