Способ выделения протеина Советский патент 1980 года по МПК C07K1/16 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНА

(54;

Изобретение относится к способу выделения протеинов с различными мо лекулярными массами, с использованием хроматографии, который может найти применение в микробиологии дл выделения и очистки вирусов. Разделительная хроматография широко используется для очистки и раз деления организованных фракций бактериальных или вирусных тел, макромолекул l, 2. Высокой чистоты про теины-вирусы получены при использовании хроматографии на эластичных гелях, например шариках агара i. Однако этот носитель имеет существенные недостатки: низкую механичес кую прочность, не вьздерживает стери лизации нагреванием, что ограничивает его применение для разделения продуктов, которые должны быть сохранены стерильными. Наиболее близким к описываемому является способ разделения протеина хроматографией на силикагеле силикагель промывают водой, 1%-ным водным раствором карбовакса 20 М при при последующей промывке температуру снижают до 9°С. Затем колонку вновь промывают водой и буфером (рН 5,5-7,6), разделение проводят при низкой температуре (9°С) , дезактивация силикагеля карбоваксом 20 М предотвращает адсорбцию протеинов, разделение их осуществляют за счет градиента концентрации соли в элюирующем буфере и изменения рН и при приложении повышенного давления (несколько десятков бар). Недостаток способа состоит в том, что протеины могут быть разделены только, под действием сильных дав.пений. Кроме того, способ применим только к аналитически чистым протеинам невысокой молекулярной массы (25 000 - 800 000): лизоцим, альбумин, каталаза, тироглобулин, цитохром С. Способ неприменим к протеинам с высокими молекулярными массами (выше миллиона), с чем встречаются при выделении и очистке вирусов гриппа, средние молекулярные массы которых вЕгпле нескольких миллионов. Цель предлагаемого изобретения способ выделения протеинов с высокими молекулярными массами и упрощени процесса. Поставленная цель достигается описываемым способом выделения протеина из водной среды путем разделительной хроматографии на твердом носителе, предварительно пассивированном водным раствором полимера и элюировакием протеина буферным раствором с рН 5,5-7,6, заключающийся в том, что в качестве твердого носителя используют силикагель или силикат щелочного металла с частицами размером от 40 до 200 мкм, порами диаметром от 5 до 200 нм, носитель после первичной пассивации водным раствором полимера с молекулярной массой от 5000 до 30000, пассивирую повторно 0,2-20%-ным водным раствором протеина с молекулярной массой меньше молекулярной массы вьщеляемого протеина.

Предпочтительными вариантами способа являются использование в качестве полимера для первичной пассивации полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона или полипропиленгликоля В качестве протеина для повторноэ о пассивирования протеины с молекулярным весом меньше 100000 - альбумин, желати-н, пептон или продукты разложения полипептидов. Использование буферного раствора с добавкой антисептика в количестве от 0,1 до 10 г представляющего собой дихлорметан, дибромметан, дийодметан, 1,2-дихлорэтан, дибром-1,2-этан или трихлорэтилйн. Использова ше в качестве вьщеляемого пептида вируса.

Пример 1. Подготовка колонны. Колонну с внутренним диаметром 10 см и высотой 120 см заполняют порошком силикаг еля Сферозил Хов 030 (рон-Пуленк) в виде частиц размером 100-20-0 мкм, со средним диаметром пор нм и- удельной поверхностью 50 , объем пор наполнителя 1 мл/г. После стерилизации паром помещенный в колонну гель предварительно пассивируют, т.е. обрабатывают водным 1%-ным раствором полиэтйленгликоля молекулярной массы 20 000 в течение 24 ч для блокировки его г дсорбционноспособных участков. Затем в колонну загружают 500 не содержащей гриппозный вирус алантоисной жидкости, с помощь которо.й проводится повторная пассивация .

Циркуляцию раствора через колонн осуществляют при незначительном поBtittiieHHH давления на входе в коло -:ну (примерно 1 бар.).

Из 450 мл вирусного раствора :з результате его хроматографической очистки получают 1050 мл элюата, содержащего вирус высокой степени чистоты.

На чертеже представле.ча хроматографическая кривая выделения вируса гриппа штамма А/х53 из его алантоисной питательной среды, по оси ордиHciT отложены оптические плотности

элюата, по оси абсцисс - объемы элюата. Чистому вирусу соответствует пик V, примесям соответствует пик 1, прерывистость пика 1 вызвана изменением расхода элюата с 9 до 27 л/ч. При работе с аналитической хроматографической колонкой (диаметр 0,8 см, высота 120 см), заполненной такой же двуокисью кремнйя, как указано вьтше f получают раствор чистого вируса, не содержащий примесей (1050 мл)

Баланс составляют путем определения активности вируса в растворе по методу гемагглютинации (ГА). Установлено, что в 450 мл исходного алантоисного раствора активность составляет 1200 единиц ГА/0,25 мл. Активность раствора вируса после хроматографической очистки - 480 единиц ГА/0,25 мл. Объем элюата - 1050 t-vi. Таким образом, активность в исходном растворе 2160000 единиц ГА, активность в очищенном растворе вируса 2016000 единиц ГА. Следовательно, выход: (2016000:2160000) 93,8% Этот выход намного выше выхода, получаемого при использовании известного метода очистки.

За этой двойной пассивацией следует промывка водным стерильным буферным раствором первичного фосфата калия и вторичного фосфата натрия с рН 7,5, содержащим NaCI в концентрации 0,15 М.

Пример 2. Выделение вируса гриппа штамма А/х53 из его алантоисной питательной среды. Раствор вируса из классической культуры в алантоисной полости куриного эмбрионального яйца, после инкубации в течение 10-12 дней содержит 1 200 единиц ГА (метод гемагглютинации) на 0,25 мл.

450 iviri этого раствора вводят в колонну, скорость пропускания раствора 150 мл/мин. В течение этого времени через колонну постоянно пропускают буферный раствор со скоростью 9 л/ч до появления одного вируса на выходе из колонны (л/ЗО мин) . Скорост подачи буфера утраивают (до 27 л/ч), что позволяет провести весь процесс за 1 ч.

Колонна, снабженная автоматическим устройством, функционирует без перерыва в течение всего необходимого для проведения процесса времени,,

Определение составляющих элюата на выходе из колонны осуществляют по оптической плотности в ультра-фиоле;товой области при длине волны 252 нм

Пример 3. Выделение 1фипп озного вируса двойным способом адсорбции - элюирования на эритроцитах с последующей очисткой путем хроматографии на силикагеле.

SO л ВИРУСНЫХ алантоисных жидкостей, происходящих из эмбриональных куриных яиц, 10-12 дневных, предварительно осветляют центрифугированием, для удаления нерастворимых веществ. Надосадочная жидкость имее 1200 единиц ГА в 0,25 мл, К полученной жидкости добавляют 4 об,% осадка куриных эритроцитов. Через 8-16 ч при температуре +4с или +37 С, эритроциты отделяют цент рифугированием со скоростью 3 000 о мин и вирус элюируют фосфатным буфером в объеме 5 л. Элюат имеет гемагглютинатный титр 12000 единиц ГА в 0,25 мл. 450 мл этой вирусной суспензии автоматически вводят в колон ну, в течение 3 мин (с расходом 150 мл/мин). В течение этого времени непрерывно пропускают через колонну описанный в примере буферный раствор(расход этого раствора 9 л/ч до появления только одного вируса на выходе из колонны. Расход утраивают (27 л/ч), когда в элюате не обнаруживают более вируса, элюат пр этом содержит загрязненные протеины Каждая операция длится 1 ч. Благода ря своему автоматическому устройству, колонна функционирует непрерывно, при этом расходуется 5 л элюата Фракции, соответствующие очищенным вирусам, собирают, получают 15 Титр этого раствора в гемагглютинат ных единицах составляет 32 00 единиц ГА на 0,25 мл, что означает выход порядка 100%. Пример 4. Исходя из 10 л раствора алантоисной жидкости, заря женной гриппозным вирусом, подобного описанному в примере 2, осуществ ляют в первой стадии концентрирование-очистку на полимерном комплексе кальция. Для этого к раствору добав ляют водный 2%-ный (вес.%) раствор полиэтиленгликоля молекулярной массы 20 000 и 12 г виде порош Смесь гомогенизируют в течение 30 мин, осадок отделяют декантацией с последующим центрифугированием, осадок обрабатывают примерно 500 мл водного 0,2 М раствора динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, рН которого доведен до 7,5 с помощью б н. раствора едкого натра. Полученный таким образом раствор ц ентрифугируют для удаления нерастворимой части и верхнюю прозрачную жидкость (около 500 мл) собирают. Выход этой операции концентрирования-очистки найден близким к 65 500 мл этого концентрированного раствора хроматографируют в колонне с внутренним диаметром 10 см и высотой 120 см снабженной такой же двуокисью кремния, что и в примере 1, и используют такой же буферный раствор. 500 мл вводят как описано в при мере 2. Вирус собирают элюированием в 1500 мл раствора, титр которого 10 800 единиц ГА/0,25 мл, что соответствует выходу очисэки, близкому к 98%. Полученный раствор вируса одновременно очень чистый и концентрированный. Пример 5. Aлaнтoиqнyю зараженную жидкость, как описано выше, концентрируют диафильтрацией на мембранах или полых волокнах. 50 л таким образом доводят до объема 5 л или меньше. После осветления этот концентрат непосредственно вводят в колонну, согласно описанной в предыдущих примерах модели и по такому же способу. Вирусный пик содержит совокупность гемагглютинатных единиц, которые были предложены. Этот раствор, очень чистый в отношении протеинов, может быть загрязнен фосфолипидами желточного мешка, организованными в мицелы; это загрязнение отделяют ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы. При удалении всех примесей с помощью разделительной хроматографии выход на всех операциях увеличивается. Пример 6. 500 л зараженной алантоисной жидкости, как описано выше, очищают путем ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы. Объем фракций, соответствующий пику вируса на графике, составляет объем 1л. Выход этой операции 30-80%. Эту фракцию вводят автоматически в колонну с силикагелем, как это описано в примере 2, и осуществляют разделительную хроматографию по способу этого примера. Собирают 3 л элюата. Выход операции хроматографии бли-зок к 100%. Пример 7. Операции, реализованные в этом примере, идентичны таковым описанным в примерах 2, 3, 4, 5 и 6. Однако вирусная суспензия, подвергнутая разделительной хроматографии, предварительно инактивирована формалином, fi -пропиолактоном или ультрафиолетовым излучением, и/или обработана органическим растворителем. Пример 8. Хроматографическую колонну, подготовленную согласно примеру 1, используют для очистки водного, с примесью, раствора катгшазы, извлеченной из бычьей печени. Этот раствор имеет активность 220 международных единиц. Элюат буферируют при рН 7. Получают раствор с активностью 1800 между народных единиц, выход составляет 86%. Пример 9. Повторяют операции, описанные в примере 2 при использовании описанной в примере 1 колонны, но наполнитель колонны представляет собой стеклянные шарики размерами 80-280 мк, средний диаметр пор которых составляет 50 нм.

Выход очищенного вируса составляет 87%.

Пример 10. Очистку вируса штамма Е/НК осуществляют согласно примерам 1 и 2, за исключением второй пассивации наполнителя колонны, используют 500 мл водного 6%-ного раствора лактальбумина молекулярной массы около 18 000. Выход 92%.

Пример 11. Указанный в примере 10 лактальбумин заменяют |8%-ным раствором мясного пептона, т.е. продуктов протеолиза полипептидов мяса. Выход составляет 93%.

Пример 12. После выделения вируса согласно примеру 2 полученный продукт (А) исследуют с точки зрения его микробной флоры: количесво микробов на мл указано ниже,,

Подобное выделение осуществляют с той разницей, что к буферному рас:вору добавляют 5 г хлороформа на литр для стерилизации среды: полученный раствор В содержит очень ьшло микробов. В операции С добавляют тот же антисептик в количестве 5 г/л как к буферному раствору, так и к обрабатываемой жидкости. Результат подобен В. Вирусную среду подвергают зональному ультрацентрифугированию, после обычного добавления 0,01% метиолята и 0,02% формальдегида.

Пблучены следующие результаты, микробов/мл:

A.Хроматография, без антисептиков10

B.Хроматография, хлороформ в буфере 10

C.Хроматография, хлороформ в буфере и в обрабатываемой жидкости 10Д. Зональное ультрацентрифугирование метиолят + формальдегид 3 000

Кроме того, полученные в операциях А, В к С вирусы живые, в то время как полученный в операции Д вирус неактивен. Более того, полученные в результате операций в и С, с хлороформом, продукты сохраняют тот же самый инфекционный титр и обладают той же самой гемагглютинатной способностью, как и продукт, полученный в операции А,вьщеление которого осуществлялось безвсякого антисептика.

Пример 13, Вирусный раство подобный тому, что использован в опытах А-Д в примере 1, но соответствующий другим штаммам вируса, подвергают разделению по способу,, описанному в примере 2.

Таким образом, были исследованы жидкости, полученные в 3 вирусов гриппа: А/СССР, А/Техас,, В/НК

В каждом случае, осуществляют хроматографию, элюируя буфернглм расвором, содержсццим 5 г хлороформа в 1 л или без хлороформа. Кроме тог проводят сравнительные выделения путем зонального центрифугирования.

Ниже даны выход, % по отношению к исходной жидкости, и вирусный тит (в международных единицах на мг протеина) .

Выход, %

А/СССР А/Техас Н/НК Хроматография с хлороформом 88 77,5 88 Хроматография без

хлороформа 81 71,5 81 Зональное ультрацентрифугирование {метиолят+формальдегнд) 72 50 63

Международная ед/мг

протеина Хроматография с хлороформом 19800 23400 26200 Хроматография без

хлороформа 15900 12100 19200 Зональное ультрацентрифугирование (метиолят+формальдегид) 12900 13600 15300 Результаты показывают, что добавление хлороформа улучшает как выход, так и .концентрацию вируса в полученном продукте. Из результатов полученных при осуществлении процесса описанного в примере 13 найдено, что выделенный в присутствии хлороформа вирус живой и имеет тот же самый инфекционный титр и обладает той же самой гемагглютинатной способностью, как и вирус, полученный в результате хроматографии без хлороформа. Напротив, вьщеленный- центрифугированием с классической стерилизацией вирус является неактивным.

Пример 14. В операциях, подобных В и С примера 12, используют бромоформ в концентрации около 1 г/л что соответствует максимуму растворимости CHBr.j в зоде. Находят около сотни микробов, на мл, в конечной жидкости.

Пример 15. Замена хлороформа в примере 12 на 1,1, 2-трихлорэтан, по 4 г/л (растворимость 4,4 г/ при 20°С) , приводит к значительному уменьшению микробной флоры, менеге 30 микробов/мл.

Пример 16. Операции примера 2 реализуются в колонне, описанной в примере 1 но без второй пассивации, т.е. без обработки наполнител алантоисной . жидкостью. Выход виру са равен 70%. Пример 17. Работая без вто рой пассивации, как в примере 16, причем наполнитель представляет со бой такие же стеклянные шарики, ка в примере 9, получают выход 64% (по сравнению с 87%, пример 9). Условия расхода элюирующего сред ства, количество обрабатываемой инжектируемой в колонну жидкости, 1частота этой инжекции, описанные в примерах, не являются ограничитель ными , их можно изменять в широких пределах. Пример 18. Растворы алантоисной жидкости, зараженной вирусо приготовляют известным образом, с помощью разл 1чных штаммов вируса. В эти растворы вводят 6 г/л хлороформа. Ниже показано, что введение хлороформа не изменяет инфекционный:: титр и гемагглютинатную способность этих растворов. А/Викто- А/Х47 НК 7 рия 75 Титр: ГА до хлороформа 210 160 290 спустя 24 ч 210 160 280 2дня 180 спустя 3дня 230 160 спустя спустя 5 дней Диаметр частиц, мкм 100-200 50-100 10 Средний диаметр пор , им Удельная поверхность, рН элюента 1-й агент пассивации . Полиэтиленгликоль По молекулярная масса 20000 2-й агент пассива- Яичный альбумин (нез ции, ная алантоисная жид молекулярная масса Выход, %93,3 93,0

Формула изобретения 1. Способ выделения протеина из водной среды путем разделительной хроматографии на твердом носителе, предварительно пассивированном водным раствором полимера и элюированием протеина буферным раствором с рН 5,5-7,6, отлич ающийся 60 140 50 230 7,5 7,0

тем, что, с целью упрощения процес- . са, в качестве твердого носителя используют силикагель или силикат щелочного металла с части.цами размером от 40 до 200 мкм, порами диаметром 9 5 Д° 200 нм, носитель после первичной пассивации водным раствором полимера с молекулярной массой екционный р: без хлороформас хлороформомЮПример 19. Иcпытaния аналоные тем, которые проведены в мере 13 с различными антисептикав буферном растворе, дают следуюрезультаты. Концентра- Микробы, Антисептик ция, г/л обнаруженные на мл (средние округленные значения) Никакой 6 200 Дихлорметан 6 100 Дибромметан . 640 Дийодометан Дихлор-1,2-этанДибром-1,2этанТрихлорэти1300лен 20-23. По методу Примеры ведения примеров 1 и 2, проведехроматографические анализы, и этом проводилось изменение некоых факторов, которые указаны в лице, где результаты примера 2 ведены в качестве сравнения. 0-200 40-80 50-150 30 10 70 420 6,5 6,7 Полипроливинилпирропиленлиденгликоль 6000 29000 Лактальаряжен- Пепкость) тон, бумин 44000 18000 92,6 92,9 90,7

от 5 000 до 30 000 , пассивируют повторно 0,2-20%-нь м водным раствором гпротеина с молекулярной массойменьше молекулярной массы выделяемого ; протеина,

робой дихлорметан, дибромметан, дийодметан, 1,2-дихлорэтан, дибром-1,2-этан или трихлорэтилен.

Приоритет по пунктам:

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2,Jshaiuhu Shechter, Separation of Proteins b High-Speed Pressure liguid Ch roma tog ra ph-j , . Biochemistry , 197, 58, 30.