(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ;ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИЙ, И 13ЫВАЕМЫХ PSEUDOHONAS AERUGiNOSA
1
Изобретение относится к вакционно-сывороточному производству.
Известен способ получения вакцины против инфекций, вызываемых Pseudomonas aerugtnosa, на основе натурального эндоток.синного белка, полученного из Pseudomonas aeruginosa М .
Однако вакцина, полученная известным способом, обладает недостаточно высокой иммуногенностью.
Целью изобретения является повышение иммуногенных свойств вакцины.
Эта цель достигается тем, что натуральный эндотоксинный белок, токсоид эластазы из Pseudomonas aeruginosa и токсонд протеазы из Pseudomonas aeruginosa растворяют в растворителе до концентрации 0,1200&0{ /мл, 1-4000 iJ5 /мл и 14000 5 /мл соответственно иСмешивают. их в. этих концентрациях в стерильных условиях.
Кроме того, в качестве растворителя используют дистиллированную воду, физиологический раствор или фосфатно-буферный раствор хлористого натрия.
С целью удлинения сроков хранениям
вакцину вводят антисептик тиморосал, фенол, карболовую кислоту или формалин...
Способ осуществляют следующим образом.
5 Токсоид эластазы приготавливают из эластазы путем перевода ее в токсоид по обычной методике получения токсоидов из белковых токсинов обработкой формальдегидом или оксиме10 тансульфиновой кислотой.
Чистый раствор эластазы ( содержащий 10-15 мг ферментного белка на 1 мл (50 единиц протеиназы на 1 мг ферментного протеина), 5 молей хлористого натрия, 10 ммолей ацетата
натрия, 2 ммоля хлористого кальция . и 0,1 ммоль хлористого цинка), разбавляют буфером бората (рП 9) до концентрации фермента 2-5 м1:/мл
20 (окончательная концентрация бората составляет 0,1 М) и добавляют формалин до получения окончательной концентрации 1% (процентное соотношение объемовJ. Смесь выдерживают
25 при комнатной температуре. Через один день достигается почти полная дизактивация. Дезактивированный .таким образом раствор эластазы диализируют водой и лиофилизируют
30 до получения токсоида.
Под термином единица протеиназы, используемым здесь, подразумевается активность протеиназы, определяемая по следующей методике.
Казеин (2% по процентному соотношению объемов, рН 7,4) (1 мл) смешивают с соответствующим образом разбавленным раствором фермента и по окончании реакции при в течение 10 мин немедленно добавляют останавливающий реакцию раствор, соде 5жащий 0,1 моль трихлор:УКсусиой кислоты, 0,2 моля уксусной кислоты и 0,2 моля ацетата натрия (2 мл). Смесь выдерживают при той температуре 20 мин до полного осаждения непрореагировавшего казеина и затем профильтровывают. подвергают определению на ти:розин по методике ФолаПна. Увеличение 1 ед. тирозина в минуту указывает на активность протеиназы :равную единице.
Физические и химические свойства полученного таким образом токсоида эластаэы следующие.
Молекулярный вес: 47000 (фильтрация геля).
Спектр поглощения ультрафиолетового излучения: максимально 278 нм ( 21,2,0,1 М КС 2), минимально 252 нм.
Изоэлектрическая точка: рН 6,5 (электрофорез с ацетатной пленкой).
Внешний вид: бесцветный порошок.
Содержит остатки аминокислот, г/100 г белка: аспарагиновая 14,2; треонин 5,0; пролин 2,9| глицин 5,6 аланин 5,8, валин 4,9, метионин 2., 9 иэолейцин 2,7; лейцин 3,9; тирозин 9,9/ фенилаланин 7,0; лизин 3,9) гистидин 2,6; аргинин 6,5, цистин-2 1,20 триптофан 2,3; аммиак 0,9, всего 94,7 г.
Активность эластазы не наблюдается.
Активность антигена наблюдается.
Токсоид протеазы может быть приготовлен из протеазы переводом ее в ТОКСОИД обработкой, например, формальдегидом или оксиметансульфинатом в присутствии аминокислоты.
Пример получения токсоида протеазы.
Кристаллы протеазы из Pseudomona aeruglfrosa (100 мг) растворяют в 0,1 MtpacTBOpe , содержащем . 0,2 моля лизина (около 20 мл) и добавляют формалин до получения окончтельной концентрации 8% (процентное соотношение объемов). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3-х или более дней и Зс1тем подвергают дигшизу водой и лиофили. зациидо получения токсоида.
Физические и хикдаческие свойства полученного таким образом токсоида протеазы следующие.
Молекулярный вес: 63000 (фильтрация геля).
Спектр поглощения ультрафиолетового излучения: максимально 280 нм (,° 9,27, 0,1 М КО), минимально 250 нм.
Изоэлектрическая точка: рН 5,2 (фокальный электрофорез).
Внешний вид: бесцветный порошок.
Содержит остатки аминокислот, Г/100 г белка: аспарагиновая 15,6; треонин 5,0, серин 7,6; глутаминовая 9,5, пролин 2,1, глицин 7,7; аланин 8,5; валин 5,о; изолейцин 3,9; лейцин 8,7; тирозин 6,9; фенилаланин 5,9; лизин 4,1; гистидин 1,9; аргинин 2,3| триптофан 2,3; аммиак 1,4; всего 98,5 г.
Активность протеазы не наблюдается.
Активность антигена наблюдается.
Для получения вакцины инфекционно-защитный обычный антиген натурального эндотоксинного белка СНЭБ) ,токсоид эластазы и токсоид протеазы растворяют в растворителе в оптимальной пропорции. При необходимости в полученный раствор может быть добавлена усиливающая действие присадка и/или антисептик.
Растворитель может быть использован любой, приемлемый для приготовления вакцин для человека и животных, например, дистиллированная вода, физиологический раствор хлористого натрия, раствор хлористого натрия, содержащий фосфат в качестве буфера и т.д.
В качестве присадки может быть использована любая обычная присадка, например, гидроокись алюминия, фосфат сшюминия, фосфат кальция, квасцы или неполная присадка Фреунда Количество присадки можно выбирать из предела количеств, необходимых и достаточных для повышения активности иммунизации. Антисептик также может быть Обычным, например, тимеросал, фенол или формалин.
Для повышения защитного эффекта пропорцию компонентов в вакцине можно изменять в пределах эффективных количеств. Количество каждого компонента значительно изменяется в зависимости от количества иммунизации и от интервала между иммунизациясми. Оно изменяется также в зависи мости от цели использования вакцины (т.е. профилактического или терапевтического) .
Ниже приводятся некоторые примеры предпочтительных доз и пропорций антигенов.
Для человека а также для рогатого скота) ..
Когда иммунизацию проводят 2-3 раза в неделю (без присадки), предпочтительны следующие пропорции: НЭБ
|0,1-10 ед. на 1 кг веса тела токсоид протеазы 1-50 ед. на 1 кг зеса тела; токсоид эластазы 1-50 ед. на 1 кг веса тела. В зависимости от сотояния иммунизации эти количества могут быть увеличены,
Профилактическая вакцина.
Когда иммунизацию проводят два раза (с использованием присадки) предпочтительны следующие пропорции НЭБ 10-2000 ед. на голову; токсоид протеазы 10-2000 ед. на голову, токсоид эластазы 100-2000 ед. на голов
Когда иммунизацию проводят один раз, рекомендуются следующие пропорции: НЭБ 500-2000 ед. на голову, токсоид протеазы 500-4000 ед. на голову, токсоид эластазы 500-4000 ед. на голову.
Терапевтическая вакцина.
Когда иммунизацию проводят 2-3 рза с интервалом в одну неделю (с использованием или без использования усиливающей действие присадки, предпочтительны следующие пропорции: НЭБ 0,1-100 ед. на голову/ токсоид протеазы 10-2000 ед. на голову; токсоид эластазы 10-2000 ед. на голову
Вакцину можно вводить животным или человеку внутримышечно или подкожно.
Токсичност.ь каждого компонента в вакцине следующая.
НЭБ: инъекция в брюшину мьойи дозы 100 мг/кг вызывает временную астению, однако животное не погибает. При обычном испытании на кроликах в отношении свойств НЭБ вызывать пирекцию наблюдается положительный эффект с дозой 0,3 мг/кг. Токсичност НЭБ как эндотоксична очень мала в сравнении с токсичностью липополиозы (ЛП) и смеси НЭБ и ЛП.
Токсоид эластазы и токсоид протеазы. Введение внутрибрюшинно мыши дозы 1 мг на вес мыши не вызывает острого отравления. Минимальная летальная доза протеазы составляет 0,2 мг на вес мыши, а минимальная летальная доза эластазы - 0,125 мг на вес мыши.
При иммунизации вакциной эффект защиты от инфекций, вызываемых P.aeruginosa, значительно увеличивается в сравнении с имлгунизацией простой вакциной, содержащей только НЭБ. Поэтому вакцина высоко эффек-тивна: для профилактики и лечения инфекций, вызываемых P.aeruginosa у животных и человека.
Антитела или сыворотку, содержащую антитела, которую получают прививкой вакцины животным и человеку, можно использовать для защиты ран (например язв, роговиц) от инфекций вызываемых Pseudomonas aeruginosa, и для их лечения.
Пример 1. Раствор токсоида протеазы и калиевых квасцов.
Токсоид протеазы (100 мг) растворяют в водном растворе хлористого натрия, содержащем 24,8 мл фосфатного, буфера (рН 7,4), и добавляют 25 мл 10%-ного раствора калиевых квасцов K2,Al2(SO) . К полученному ра створу добавляют 2,5 мл 20%-ного раствора .12Н20 и устанавливают рН 6,5, чтобы вызвать полное осаждение. После этого добавляют 1%-ный раствор тимеросала (0,3 мл)
в качестве антисептика (1 мг токсоида протеазы на 0,3 мл).
Раствор токсоида эластазы и калиевых квасцов. Раствор приготовляют так же, как и в первом случае, но
5 с использованием токсоида эластазы вместо токсоида протеазы.
Раствор {ЭБ и калиевых квасцов. НЭБ (100 мг) растворяют в 0,01 н. растворе NaOH (5 мл) и добавляют фосQ ратный буфер (28 мл) . К полученному раствору последовательно добавляют 10%-ный раствор калиевых квасцов (3,3 мл) и 20%-ный раствор (3,3 мл), после чего добавляют 1%г ный раствор тимеросала (0,4 мл).
Приготовленные таким образом раствор токсоида протеазы и алюминиевых квасцов, раствор токсоида эластазы и алюминиевых квасцов и раствор НЭБ
0 и алюминиевых квасцов непосредственно перед использованием перемешивают. В 0,5 мл этого смешанного раствора содержится 500 ед. токсоида эластазы, 500 ед. токсоида протеазы и
5 500 ед. НЭБ.
.Пример 2. Раствор токсоида протеазы и гидроокиси алюминия, раствор токсоида эластазы и гидроокиси алюминия и раствор НЭБ и гидроокиси
0 алюминия приготовляют так же, как в примере 1, но с использованием 10%-ного раствора гидроокиси алюминия вместо 10%-ного раствора калиевых квасцов.
С Приготовленные таким образом „три раствора перемешивают непосредственно перед использованием.
Полученная вакцина обеспечивает гораздо больший эффект защит от
Q инфекций, вызываемых P.aeruginosa в сравнении с обычной вакциной, содержащей только НЭБ.
При использовании одного НЭБ (группа А) 205дсоетавляет 3, или меньше. В отличив от этого в
5 группе Б, иммунизированной вакциной, ZOgQ превышает 1,9 х Ю и, тем , она существенно отличается от группы А. В необработанной группе ZDgQ составляет 3,4 10. При иммунизации
0 ЙЭБ величина ZDggобычно от 100 до 1000 раз повышает сопротивление к количеству живых бактерий в сравнедии с необработанной группой.
При использовании йредлагаемой
5 вакцины, содержащей токсоид протеазы
и токсид эластазы в дополнение к НЭБ, иммунизированные животные приобретают сопротивление к количеству
живых бактерий в раз большее в сравнении с необработанной группой (см.таблицу).
