Способ получения биомассы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/06 

Изобретение относится к технике выращивания микроорганизмов, исполь зуемых для получения биомассы на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода. Известен способ получения биомас сы путем культивирования микроорганизмов - бактерий рода Methy1oraonas на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода источник азота и необходимые соли в условиях аэрации с последующим в.ьще ле.нием биомассы одним из известных способов Недостатком известного способа является то, что иcпoльзye 1ыe в нем микроорганизмы не обеспечивают дост точно эффективного использования ме танола и имеют невысокую скорость роста, вследствие чего содержание белка в биомассе невысокое и биомас са не может быть использована в качестве пищевой добавки. Цель изобретения - повышение содержания белка в биомассе и возможkocTb ее использования в качестве пищевой добавки. Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения биомас-сы из рода бактерий Methylomonas используют, штамм Methylomonas probus FERM-P 3193, при этом культивирование ведут при температуре среды 35З7с и рН 6,3-7. При этом концентрация метанола в питательной среде составляет до 4 об.%. Кроме того, скорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают с 40 л/ 20 л/мин до 60 л/ /20 л/мин. Культивирование микроорганизмов осуществляют с постоянной скоростью аэрации среды, равной 10л/20 л мин или 20 Л/20Л/МИН или 40 л/20л/мин или 60 л/20 л/мин или 80л/20 л/мин или 100 л/20 л/мин. Способ осуществляют следующим образом. Микроорганизмы - бактерии рода Methy1omonas-штамм Hethylomonas probus FE RM-P № 3193 культивируют на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода метанол,, при этом концентрация последнего в питательной среде не превышает 4 об.%, источник азота и необходимые соли в условиях аэрации. Культивирование ведут при температуре среды 15-41 с/ прелпочтительно 35-37 0 и рН в пределах 5,3-9,1, предпочтительно 6,3-7,

Скорость роста бактерий снижается постепенно, если концентрация метанола превьлиает 4 об. %. Метанол по мере увеличения размера колонии бактерий, в случае необходимости, добав-j ляют в течение всего времени выращивания.

Скорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают с 40 л/20 л/мин до 60 л/20 л/мин. Культивирование микроорганизмов осуществляют также с постоянной скоростью аэрации среды, равной 10 л/20 л/мин или 20 л/20л/мин, или 40 л/20 л/мин, или 60 л/20 л/мин, или 80 л/20 л/мин, или 10.0 л/20 л/мин.

Максимальное количество бактериальных клеток получают примерно через 48 ч после начала выршцивания.

Содержание грубого протеина в бактериальных клетках может быть равным, примерно 80%.

Бактериальные клетки имеют высокую питательную ценность, не токсичны и обеспечивают получение источника протеина, добавляемого в корм и пищу.

Используемый штамм Methy lomon.as probus FERM-P№ 3193 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Форма и размер клетрк: 1 или 2 до 3 цепная бацилла с размерами 0,5-0,,0-1,5 мкм; клетки не обладают полиморфизмом, передвигаются при помощи единственного полярного жгутика, споры отсутствуют,, результат окрашивания по способу Грэма отрицательный.

Морфологические свойства исследуют на клетках, выращенных в синтетической среде неорганических солей при в течение 24-48 ч, содержащей, г (NN4 )г НР043 ,5 j 1,5; l,5;MgSO4-7H2.0 0,3; CaCl22H2 0 0,01; FeS04 7Н,0 0,01; метанол 2 об.%, вода 1 л.

Штамм не обладает устойчивостью относительно кислоты.

Условия роста.

На агаровой пластинке с культурой в синтетической среде неорганических солей бактерии быстро размножаются и образуют ровные, сплощные и выпуклые круглые колонии.Колонии полупрозрачные с блеском сероватого, белого или розового цвета.

На скошенном агаре с культурой в синтетической среде неорганических солей рост бактерий наблюдается во всей среде. Колонии имеют нитевидную (iiopMy с блеском сероватого, белого или розового цвета. Смешанной окраски не наблюдается.

В чашке с бульонным агаром нет признаков роста или слабый рост. Колония имеет размеры менее 0,5 мм.

после выращивания 48 час при . Колония имеет ровную, круглую фору, блеск и прозрачность.

На бульонном скошенном агаре нет признаков роста или слабый рост. В последнем случае, колония имеет нитевидную Форму и прозрачность.

На бульонной жидкости нет никаких признаков роста.

На насыщенном желатиновом бульоне нет никаких признаков роста, и желатина не разжижается.

На лакмусовом молоке не наблюдается никаких изменений. Добавленле 1% метанола не производит никаких изменений.

Физиологические свойства.

Нитраты восстанавливает. Индол не образует.

Сернистый водород не образует крахмал не гидролизует, лимонную кислоту не использует. Образование пигмента: образует небольшое количество желтого пигмента, растворимого в воде, в синтетической жидкой среде неорганических солей. Бактериальные клетки серовато-розовые.

Использование источников азота, хлорид, сульфат, нитрат аммония, первичный и вторичный фосфат аммония, мочевина, карбонат аммония и полипептон в неорганических питательных растворах. Используют нитрат, нитрит, метиламин и экстракт дрожжей.

Мочевину образует. Окисляется, катализ положительный.

Условия роста: рН 5,3-9,1, предпочтительно 6,3-7,0.

Температура.15-41°С, предпочтительно 35-37оС.

Отношение к кислороду - аэроб.

Образование газа и кислоты не наблюдается по способу Хью Лейфсона.

Пара-оксибензоат не использует. Аммоний не образует.

Ферментации Сахаров (при наблюдении в течение 30 дней раствора пептона с добавлением 1% Сахаров: L-apaбиноза Д-ксилоза Д-глюкоза Д-манноза: Д-фруктоза, Д-галактоза, мальтоза ) сукроза, лактоза, треалоза, L-рамноза, маннит, сорбит, глицерин, крахмал) не образует.

Пример 1. Компоненты растворяют в 1 л ионообменной воды в

количестве, г: -(NN4) KII2.PO4 1,5; 1,5; MgSO4-7H2 O 0,5; FeS047H O 0,1, получая раствор с рН 7,0.

Затем по 100 мл этого раствора помещают в несколько колб, емкостью 300 мл, а после стерилизации в каждую колбу доб.авляют 1, б г метанола, получая среду для выращивания бактерий Methylomonas probus FERM-P . № 3193, которые до этого выращивают на среде со скошенным агаром.

Процесс ведут при взбалтывании культурь4 в. течение двух дней при

0 С. Затем клетки отделяют в сепара оре, промывают ионообменной водой сушат при 110°С до стабилизации еса, получая 7,2 г сухих клеток на л культуральной жидкости.

Выход составляет 45,0% в пересчете на добавленный метанол.

Пример 2. 200 мл метанола 1 % объем/объем вводят в ферментер емкостью 30 л, содержащий 20. л аствора при рН 7,0 следующего состава, r:(NH4)iliPO 4,0; КН2Р04 1,0; KiHPO 1,0; MgS0. О, 5 и 7Н20 0,1 в 1 л ионообменной воды.

Раствор стерилизуют и в эту среду засевают 2% объем/объег1 j бактерий Methylomonas probus FERH-P t 3193) которые до этого Быра11ивают в той же среде.

Процесс ведут при перемешивании со скоростью 500 об/мин, З5с и аэрации со скоростью 30 л/20 л/мин (1,5 объем/объем/мин) в течение 48 ч, при этом скоростью аэрации увеличивают постоянно до 40 л/ /20 л/мин, 2,0 объем/объем/мин/ и алее до 50л/20 л/мин/ 2,5 объем/объем/мин и до 60 л/20 л/мин (3,0 объем/ /объем,мин.)-В течение процесса выраивания рН поддерживают автоматически на уровне от 6,6 до 7,2 добавлением 14% аммиачной воды. Содержание метанола поддерживают автоматически так, что его потребление составляет от 0,3 до 1,0%, а контроль осуществляют при помощи газовой хроматографии.

Затем клетки отделяют в центробежном сепараторе, промывают ионообменной водой и сушат при до стабилизации веса.

Выход сухих бактериальных клеток составляет 25,0 г/л через 28 часов после началавыращивания )40,7 г/л через 40 часов и 53,8 г/л - через 48 часов.

Пример 3. Готовят смесь при следу 1 щем содержании компонентов, г: (NH4)2HP04 4; ( О 0,8; 1,0;К2НРО4 1,0; Мд5Ол7Н О 0,7; finS04-4-6 0,01; CuSO 5Н,О 0,01; CoCl2 6Нз,0 0,01;Fe SO-. 7Н2.О 0,1; ZnSa-7H;jO 0,01;CaCl22H.O 0,01; (NH ) Mo,O24 4Hj,O 0,01 компоненты растворяют в ионообменной воде, получая 1 л смеси.

20 л указанной смеси подают в 30л ферментер, стерилизуют при 120с 15 минут, добавляют 2% /объем/объеМ метанола и получают среду для выращивания культуры, в последнюю засевают раствор культуры Methylomonas probus FERM-P ff 3193, которую предварительно выращивают 18 ч в средетого же состава (содержание метанола 1,0% объем/объем и 2,0% Гобъём/ /объем3 . Культуру выращивают 28 ч при и перемешивании со скоростью 500 об/мин при скорости аэрации.

30 л/20 л/мин fl,5 объем/объем/мин рН среды поддерживают 6,6-7,2 с добавлением 1% аг.1миачной воды. Кон-, центрацию метанола в среде выращивания контролируют при помощи газовой хроматографии. Метанол непрерывно добавляют микронасосом так, что его концентрация остается на уровне 0,3-2,0% объем/объем 3 в течение всего процесса выращивания. Общее добавляемое количество метанола до

0 завершения процесса выращивания составляет 1,035 т.

Бактериальные клетки выделяют в центробежном сепараторе при до стабилизации веса, получая 25,6 г

5 сухих клеток на 1 л культуральной жидкости, что соответствует производительности 49,5% в пересчете на добавленный метанол.

Содержание грубого протеина соста0вляет 80,3%.

Скоростьроста бактерий определяют при помощи измерения помутнения раствора для выращивания культуры колориметром.

Максимальная удельная скорость

5 роста составляет 0,32 ч, а время образования 51 мин.

Пример 4. Бактерии того же штамма, как в предыдущих примерах, выращивают при помощи циклического

0 процесса при условиях, как в примере 3. Так как концентрация растворенного кислорода в растворе для выращивания культуры уменьшается с ростом клеток,скорость аэрации среды воз5растает до 40л/20 л/мин (2,0 объем/ /объем/мин), затем до 50 л/20 л/мин (2,5 объем/объем/мин) и наконец до 60 л/20 л/мин (3,0 объем/объем/мин), последовательно и в момент, когда

0 концентрация клеток в растворе достигает 43,6 г/л. Выращивание, как процесс периодического действия, переключается на непрерывное выращивание при ПОМО1ЦИ непрерывной подачи среды, аналогичной той, которую

5 используют при периодическом выращивании, в раствор со скоростью разбавления 0,28 ч-. Одновременно из ферментера удаляют равное количество культуральной жидкости, рН среды под0 .держивают на уровне 6,6-7,2-добавлением 14% аммиачной воды,концентрацию метанола в процессе выращийания поддерживают на уровне от 0,3 до 1,0% объем/объем}, а контроль осуществ5ляют при помощи газовой хроматографии.

Непрерывный процесс выращивания проводят при условиях наиболее высокой продуктивности 8,1 г/л в течение

0 всего процесса.

П р и м е р 5. Бактерии того же штамма, как в примере 3, выращивают при таких же условиях при непрерыв5ном процессе при скорости аэрации

30 л/20 л/мин (1,5 объем/объем7мин). Продуктивность составляет до 4,2 г/л.

П р и м ер 6. Выращивание проводят, как в примере 3 того же штамма, непрерывно при тех же условиях, при скорости аэрации 40 л/20 л/мин (2,0 объем/объем/мин). Продуктивность составляет 5,6 г/л-ч.

П р и .м е р 7. Выращивание проводят, как в примере 3, непрерывно, при скорости аэрации 50 л/20 л/мин (2,5 объем/объем/мин). Продуктивность составляет 7,3 г/л.ч .

Пример 8. Выращивание проводят при тех же условиях с использованием того же штамма, как описано в примере 3, непрерывно, при скорости аэрации 60 л/20 л/мин (3,0 объем/ /объем/мин). Продуктивность составляет 8,1 г/л- ч .

Пример 9. Непрерывное выра.щивание проводят-при скорости аэрации 80 л/20 л/мин (4,0 объем/объем/ /мин) при тех же условиях, с использованием того же штамма, как в примере 3. Продуктивность составляет 9,3 г/лЧ .

Пример 10. Непрерывное выращивание проводят при скорости аэрации 100 л/2О л/мин (5 объем/объем/ /мин) при тех же условиях с использованием того же штамма, как в примере 3. Продуктивность составляет 12,2 г/л,ч.

Пример 11. Проводят испытание, связанное с кормлением самцов крыс при использовании клеток Methylomonas probus FERM-P № 3193, вырагденных в соответствии с описанными примерами.

Испытание проводят на 60 крысах Вистера (возраст 3 недели) с применением основного корма, следующего состава, % : казеин (без витаминов) 12,0; сахар 5,0; масло соевых бобов 6,0; витамин группы В 0,3; пшеничный крахмал 61,0; порошок целлюлозы 11,5; витамины А и D 0,2; минеральные вещества 4,0, кроме того 0,2 г. После кормления крыс основным кормом в течение 5 дней их разделяют на 3 группы по 20 в каждой. Крысам первой группы продолжают давать непрерывно основной корм и используют в качестве контроля, а две другие группы подвергают испытанию и группе 1 дают в пищу основной корм без 12% витаминного казеина с добавлением 20% сухих бактериальных клеток по изобретению, а группа П - основной корм без 16% витаминного казеина с добавлением 10% сухих бактериальных клеток,

Крысы трех групп получают корм указанного состава 5 недель. Одновременно фиксируют вес животных и количество потребляемого корма.

Данные испытания приведены в таблице.

59,9+3,0. 175,2t115,3+ ,

. 16,617,0

60,1+3,1 175,5+115,4t

14; 514,9

59,8±3,0 176,3+116,5+

15,5 15,4

Результаты испытаний показывают, то различие в увеличении веса живот ных, а также.в потреблении пищи незначительное.

Внешне по блеску шерсти и подвижности животные групп I, П и контрольной группы не различаются.

Проверка внутренних органов всех групп при помощи вскрытия не обнаруживает каких-либо отклонений от нормального состояния.

4,20+ 0,41

4,04+ 0,34

4,01+ 0,3l

Таким образом, полученная биомасса имеет высокое качество и может быть использована в качестве источника протеина в кормах животных.

Формула изобретения

на питательной среде, содержсицей ме-3. Способ поп.1, отличаюТанол в качестве источника углерода,щ и и с я тем, что скорость аэрации

источник азота и необходимые соли всреды в процессе культивирования

условиях аэрации с последующим выде-увеличивают с 40 л/20 л/мин до

лением биомассы одним из известнйх60 л/20 л «.мин.

способов,отличающийся 4. Способ поп.1, отллчаютем, что, с целью повышения содержа-щ и П с я тем, что культивирования

НИН белка в биомассе и возможности«микроорганизмов осуществляют с поее использования в качестве пищевойстоянной скоростью аэрации среды

добавки, из рода бактерий Methylo-равной 10 л/20 л/мин или 20 л/

monas используют штамм Methylomonas|. /20 л/мин или 40 л/20 л/мин или

probus FERM-P № 3193, при этом куль-60 л/20 л/мин или 80 л/20 л/мин или

тивирование ведут при температуре100 л/20 л/мин, среды ЗЗ-ЗТ С и рН 6,3-7.

щ и и с я тем, что концентрация ме-принятые во внимание при экспертизе

танола в питательной среде составля-15 1. Патент Великобритании

ет до 4 об.%- 1420264, кл. С 6 F , опублик.1976.