Способ получения аденозин-5 -трифосфата Советский патент 1985 года по МПК C12N9/00 

Од И обрегснис относится к технической )биологии н касается способа получения адено- ин-5 -трифосфата, использующего про;iyuR -iyK)mne бактерии, способные ассимилировать feтa)(()л. Изнсстен ферментативный способ получения адснозин-5 -трифосфата (АТФ) путем культиви рования бактерии Brevibacterium ammoniage- nes АТСС 6871 на питательной среде, содержа щей источник фосфата, аденин или его проиэводные При рН среды 7,0, температура 20-40°С. Выход ЛТФ 3 г/л 1. Известен также способ получения АТФ, предусматривающий культивирование продуц та Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический источник фосфата, представленный (, и KHjTO при З0с рН 6,8, накопление целевого продукта и выделение в количестве 6,2-8,6 мг/мл 2 Недостатком известных способов является то, что обязательным условием биосинтеза продудента является наличие в среде аденина или его производного, такого как аденозин, используемого в Ka4ectbe субстрата. Цель изобретения - снижение себестоимост целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что при способе получения аденозин-5 -трифосфа1 предусматривающем культивирование продуци рующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неорганический фосфат, представленный () НГО, К,,ИГО и КНлРО, накопление целевого продукта и его выделение, в качестве проду1Щрующего микроорганизма используют метанолусваивающие п;таммы Protaminobacter methane 1 АТСС 21275, Corynobacterium sp. 21232, Bacillus cerus АТСС 14579, Methy 1 omonas probus PERM P-3139, Methylomonas metliylovora ATCC 21369, Pseudomonas methanolica ATCC 21704, Pseudomonas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanica ATCC 21439 или Protaminobacter ruber ATCC 8457, питательная среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, имеющую такой же марщрут метаболизма, как и метан и представленную метаном, метиламином, фор мальдегидом и муравьиной кислотой, а неорг нический фосфат используют в количестве 4- 35 г/л, рассчитанном относительно радикала фосфорной кислоты РО, Метанол и метиламин вводят в количестве 0,2-4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид - 0,01-0,1 об.%. Сущность изобретения заключается в том, что один из перечисленных метанолусваиваю щих штаммов культивируется в среде, содержащей метанол или химическое вещество. 9 имеющее тот же метаболический путь, ч го и метанол, н Р сорганический фосфат в количестве 4-35 г/л, рассчитанном но числу ГО/. Метанол или указанное химическое вещество используют в качестве источника углерода в среде, однако слишком высокая концентрация этого вещества в среде неблагоприятно сказывается на росте бактерий. Концентрация указанного вещества в среде обычно должна быть в пределах 0,2-4 об.% в слу ве метанола и метиламина и в пределах 0,01-0,1 об.% в случае муравьиной кислоты и формальдегида. Если используют метан, то его концентрация соответствует его растворимости. Подобный источник углерода может быть добавлен целиком одновременно в среду в начале культивирования, однако лучший резуль тат по отношению к выходу АТФ получают путем первоначальЕГого поддерживания в среде 1П13кой концентрации источника углерода и дополнительного добавления в среду источника углерода по мере его потребления в процессе культивирования. При этом важно иметь неорганический фосфат, содержащийся в среде в сонцентра лии 4-35 г/л, рассчитанной по числу РО, в дополнение к указанному источнику углерода. Такая концентрагдая неорганического фосфата в среде превыщает в несколько десятков раз концентра1Шю в обычной бактериальной культуре и является совершенно спе1шфической. Если ко}центрация неорганического фосфата (рассчитанная по числу РО).) в среде ниже 4 г/л, то не происходит увеличения выработки АТФ, при концентрации выще 35- г/л рост АТФ-продуцирующей бактерии замедляется, что приводит к уменьшению выхода АТФ. Неорганический фосфат в высокой концентрации препятствует секретированию продуцированной АТФ бактериальными клетками и разрушению АТФ фосфотазой. Неорганические фосфаты, используемые в изобретении, прина.утежат к соединениям, обычно применяемым при приготовлении ферментационной среды, и включают, например, (NH)HPO4, , и К„НГОл. Состав, используемый для приготовления среды, может включать, кроме названн гх источника углерода и неорганического фосфата и неорганическую соль (соль калия, магния, железа, марганца и т. д.) и в некоторых случаях неорганическую соль металла, такого как цинк, кобальт, молибден и других, также как и источник азота (аамиак, соль аммония, мочевина, нитрат и т. д.). Возможно также добавление поверхност}1О-активного вещества, антивспенивателя и других добавок. Состав используемой среды следующий, г/л: (ЫН4)-ПЮ45-45 (3,5-32 по числу 0,5-2,5 (0,35-1,75 по числу Ю) 0,5-2,5 (0,275-1,37 по числу ГО) (NH4)S04 MgSO4 7 HjO 0,5-5,0 7HjO 0,05-0,5 FeS04. CaClj- 2HjO iVlnSO.4H,jO 0-0,2 Источник углерода0,05-2 об.% Культивирование названных ЛТФ-продуцирующих бактерий в указанной среде предпочти-, тельно выполняют при следующих условиях: рН 5,8-9,0, предпочтительно 6,0-8,0. температу ра 15-50°С, предпочтительно 20-40°С, и урове аэрации 0,5-4,0 V.V.M (объем воздуха, л.объе раствора культуры л/мин), перемешивание при 40-600 об/мин, в течение 2-9 дней. Для доведения рН среды культуры могут быть использованы щелочное вещество (аммиак), кислое вещество (серная кислота), буферный агент (фосфатный буфер) пли другие пригодны вещества, такие как мочевина, углекислый кальций и т. д. В случае использования щелочного вещества наибольщее предпочтение отдает ся аммиаку, поскольку он может служить источником азота. Если указанные бактерии форментируют При указанных условиях культи вирования согласно изобретению, АТФ накапливается в среде в высокой концентрадаи 2-12 г/л. После заверщения ферментации микробы удаляют и продуцированную АТФ отделя ют и вьщеляют известным способом. Например после удаления бактериальных клеток из ферментационной среды (бульон) супернаган подвергают комбинации фракционирования и концентрирования-осаждения путем адсорбции и элюции с использованием активированного угля и анионообменной смолы, в результате че го происходит выделение продуцированной АТФ Согласно изобретению АТФ продуцируется и накапливается в среде культуры в высокой концентрации свыще 2 г/л без добавления в среду аденина или его дериватов. Количество продуцированной АТФ в случае каждом примере определяют путем использова ния принципа реакции между АТФ и люциферингЛЮ1шферазой, который выражается следующим образом: 1)Люциферин+люцифераза+АТФ - -аденизлюциферин-пирофосфат; -. 2)Аденил -люциферин - - аденИл-оксилюци ферин. Интенсивность свечения флюоресцирующего продукта второй реакции в интервале длин вол нм измеряют в течение данного периода времени с использовагчем CHEM--GLOW PHOTOMETER J4-7141 (American Instrument Со-) и полученный результат соотносят с предварительно полученной калибровочной кривой стандарт1Ш1х растворов АТФ, в результате чего определяют количество АТФ в растворе культуры. Пример 1. Основная среда готовится pacTBopeimeM 7,0 г (NH4)2HPO4, 1,0 г 1,0 г , 1,0 г MgSO. .и 1,0 г в 1 л ионообменной воды; 100 мл этой остювной среды отмеряют пипеткой в каждую из 300-маплилитровых Эрленмейеровских колб, после стерилизации в каждую колбу добавляют 1,6 г метанола, В приготовленную таким образом среду засевают Methylomones probus PERM-Р-3199, кыорый предварительно культивируютна скощенном агаре с указанным составом, после чего колбы встряхивают при .ЯО С. На 4-й дейь после засева среды в растворе культуры продуцировано и накоплено 2,8 г/л АТФ. 1 л этого раствора культуры подвергают нагреваиню при 80 С в течение 5 мин, и после охлаждения центрифугированию для осаждения бактериальных клеток, после чего супернатант, довсде П1ый до рН 3,5 3 н. соляной кислотой, обраба)ывают активированным углем пдя адсорбции АТФ и затем адсорбированную на активированном угле АТФ элюируют 50%-ным раствором алкоголя, содержащим 1,4% аммиака. Это эпюат концентрируют при пониженном давлении н при низкой температуре для удале}1ия избытка аммиака, доводя рН до 8,0. Затем концентрированный раствор пропускают через колонку сильноосновиой анионообменной смолы Dowex ( trade mark) 1-Х2(С Г ) которая предпарнтслыю доведена .до смолы СЬтипа, в результате чего АТФ адсорбируется на колонке. Адсорбат промывают ионообменной смолой и элюируют смесью соляной кислоты и хлористого натри (0.2 М раствор NaCl, полученный растворением 0,2 М раствора НС1 рН 1,7), в NaCl) и ,, фракцию АТФ отделяют. Этот эЛюат нейтрализуют едким натром, пропускают через колонку, набитую активированным углем, злюируют 15 г-ной аммиачной водой и полученный злюат концентрируют при нагревании отгонки аммиака. Путем добавления метанола к этому конценгр 1рова}пюму раствору получают 2,2 г крис галлов натриевой соли АТФ. Пример 2. 20 л , 1Григотовленной растворением 7,0 г (NH)jHPO4, 1,0 г КН РО, 1,0 г К2НЮ4, 2,0 г MgSO . и 0,2 и 0,2 мл антивсиенивателя ; К-66 в 1 л ионообменной воды загружают в i

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИН-5 -ТРИФОСФАТА, предусматривающий культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей субстрат и неоргани1|еский фосфат, представленный ()р.Ю, К,НЮ, и , накопление целевого продукта и его выделение, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют метанолусваивающие штаммы Protaminobacter methanol АТСС 2 1275, Corynobacterium sp. 21232 ,Bacillus cerus ATCC 14579, Methylomonas probus FERM-P-3139, Methylomonas methylovora ATCC 21369, Pseudomonas methanolira ATCC 21704. Pseudofrranas insueta ATCC 21276, Pseudomonas methanica ATCC 21439 или Protaminobacter ruber ATCC 8457, питательная среда содержит в качестве субстрата метанол или химическую субстанцию, ил.еющую такой же марщрут метаболизма, как и метанол, и представ ленную метаном, метиламином, формальдегидом, и муравьиной кислотой, а неортанический фосфат используют в количестве 4-35 г/л, рассчитанном относительно радикала фосфорной кислоты . 2. Способ по п. .1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что метанол, н метиламин вводят в количестве 0,2-4,0 об.%, а муравьиную кислоту и формальдегид-- 0,01-0,1 об.%.