Способ получения биомассы Советский патент 1983 года по МПК C12N1/20 C12N1/32 

СП

00

c Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения бактериальной биомассы, использующейся в Качестве корма, пищевых продуктов и т.д., путем культивирования бакт рий на питательной среде, содергжа дей метанол в качестве единствен ного источника углерода. Известен способ получения биома сы путем культивирования бактерий рода Corvnebacterium и Pseudomonas на питательЕюй среде, содержащей м танол в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, необ ходимые минеральные соли, стимуляторы роста, при аэрации среды с по ледующим отделением и сушкой полученной биомассы Cl. Выход бактериальной биомассы по метанолу составляет 40 вес, %, содержание сырого протеина 70-80%. Цель изобретения - повьпаение вы хода биомассы с высоким содержанием сырого протеина. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получени биомассы, предусматривающему культивирование продуцирующих биомассу бактерий на питательной среде, содержащей метанол в качестве основ: ного нсточ}1ика. углерода/ источник азота и минеральныесоли, в условия , аэрации среды с последующим отделением и сушкой биомассы, в качестве бактерий, продуцирующих биомассу используют Flavobacterium tosaensis (FERjM-P № 4058) или Pseudomonas wakayamaensis DS-25 FERM-P № 4100), или Flai obacterium methanolicola DS-16 (РЕШ-Р № 4098) или Pseudomonas kyotoensi.s DS-22 (FERM-P W 4099), или Pseudomonas aichiensis DS-26 (FERM-P № 4107), или Corynebacterium yamanasiensls DS-31 (FERM-P № 4106), Используемые в предлагаемом спос бе штамг и депонированы в Науч:но-исслеловательском институте ферментации Агентсва прО1%1ышленно-научных разработок и технологических процес сов в Японии. Штамг.чы имеют следующие характерн тики. Штамм Flavobacteriuni tosaensis DS-1 (FERM-P № 4058). Морфологические признаки; Штамм культивировали на питатель ной среде и питательном агаре при в те-шние 3 дн. Форма и размер клеток - палочки от 0,5-0,75 до I, мк, Колонии клеток единичные й1Ш пар ные. И одв и жн ос ти к ет Спор нет, Окрг шиваемость по Граму - отрица тельная. Кислоустойчивость - отрицатель- : ная. Рост (развитие), бактерий на различных культуральных средах: На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при в течение 3 дн, образовавшиеся колонии клеток имеют круглую форму диаметром 2-3 мм, выпуклую с однородной структурой, гладкую, ровную поверхность с целыми (неповрежденными) краями, желтовато-белые или молочно-белые (беловатые), блестящие, искрящиеся, полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные. На чашках Петри с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост при 37С в течение 3 дн, колонии клетоккруглые диаметром 2,0-2,5 Мм, выпуклые с гладкой поверхностью и ровными цельными краями, белые или опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные. На скошенном питательном агаре нитевидный рост при 37С в течение 3 дн., колонии клеток имеют гладкую ровную поверхность, умеренно выступающую и окрашенную в желтоватобелый или молочно-бе.лый цвет с блестящим глянцем, полупрозрачные и слизеподобные. На скошенном метанольном агаре нитевидный рост при З7с в течение 3 дн, колонии клеток имеют гладкую poвнyю поверхность, умеренно выступающую вперед и окрашенную в белый цвет с опалесцирующим оттенком и блестящим глянцем, полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные. На питательном бульоне - интенсивный рост при в течение 3 дн, культура становится мутной, образуется осадок (отстой), на поверхности образуется белая кольцеобразная тонкая пленка (пелликула). На водном пептонном бульоне - интенсивный рост при 37°С в течение 3 .ДН1, культура становится мутной. Образуется осадок (отстой), на поверхности образуется кольцеобразная пелликула. На метанолсодержацем бульоне интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн культура мутнеет, образуется садок, на поверхности образуется кольцеобразная пелликула. На питательном бульоне с палочкаи желатина - рост на поверхности тш протекающий до г лубины 2-3 мм ри 37 С в течение З дн. На питательном желатиновом бульоне (на палочках желатина) - поверхностный рост при 30 С в течение 5 дн с образованием осадка, при этом желатин разжижается.

На лакмусовом молоке - при 37°С образуется кислота, культура приобретает красный цвет и коагулирует

Биохимические признаки:

Нитраты не восстанавливает.

Реакция денитрификации - положительная.

Ретикулярная реакция (MR-TecT) отрицательная.

VP-тест - отрицательная реакция.

Индол не продуцирует.

Сероводород не продуцирует.

Крахмал не гидролизует.

Цитраты (в среде Козера) не утилизирует.

, Утилизирует неорганический азот, 1ммонийные соли и нитраты.

Не продуцирует pf-пигмент (в средах А и В Кинга).

Уреазная реакция - положительная

Оксидазная реакция - положительная.

Каталазная реакция - положительная.

РОСТ на метанолсодержащем бульоне при рН 5-9 (оптимальный диапазон рН 6-8). При рН 4 и 10 .роста нет.

Хороший рост наблюдается в диапазоне температур 5 - (оптимальный диапазон 25 - 42с) ; при 45°С ро9та нет.

(Отношение к кислороду - аэробная культура.

0-F тест (по методу Хьюго Лейфсона) - окислительно метаболизирует глюкозу (слабое образование кислоты

Продуцирование кислоты и газа из Сахаров (при использовании водного пептона, содержащего сахар в концентрации 1%, при 37С в течение 10 дн цзедставлено в табл. 1.

Таблица 1

Продолжение табл. 1

Д-Сорбит

+ .(слабое) Д-Маннит Инозит Глицерин

+ (слабое)

)

+ (слабое) Крахмал

Ассимиляция Сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концентрации 1% при ЗТС в течение 10 дн.) представлена в табл. 2.

Таблица 2

Ассимиляция

Сахар

25

30

35

40

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ путем культивирования продуктов ее бактерий на питательной среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, источник азота и минеральные соли, в условиях аэрации среды с последукпцим отделением биомассы и ее сушкой, отличающийся тем, что, с целью повьлиения выхода биомассы, в качестве бактерий, продуцирующих биомассу, используют штамм Flavobacterium tosaensis DS-1 (FERM-P 4058) или Pseudomonas wakayamaensis DS-25 (FERM-P № 4100), или Flavobacterium methanolicola DS-16 (FERM-P 409 , или Pseudomonas kyotoensis DS-22 (FERM-P 4099).или Pseudomonas . ; aichiensis DS-26 4FERM-P I ДЮТ), или Corynebacterium yamanasiensis bs-31 (FERM-P 4106).

+ (слабое)

Л-Арабизона Д-Ксилоза

+ (слабое) Д-Глюкоза

+ (слабое)

Д-Манноза + (слабое) Д-Фруктоза

+ (слабое)

Д-Галактоза + (слабое) Мальтоза + (слабое) Сахароза + (слабое) Лактоза + (слабое) Трегалоза

Штамм выделен из почвы.

Метанолсодержащая агаровая среда использовавшаяся в° указанных опытах (тестах) по культивации бактерий данного штамма, имела следуювщй состав/ мг:.

55

60

65

20000

Агар

Дистиллированная вода

Культуральную среду стерилизовали при в течение 15 мин, после чего прибавили в асептических условиях 20 г метанола.

Для приготовления метанолсодержащего бульона использовали аналогиную среду, но без добавления агара, а количество метанола снизили до 5 г

Штамм Pseudomonas wakayamaensi s

DS-25 CFERM-P № ,4100},

Морфологические признаки:

Штамм культивировали на питательном бульоне и питательной агаровой среде при 31°С в течение 3 дн.

Форма и размер клеток - палочки от 0,3-0,4 до 2,0-2,2 мк.

Колонии клеток единичные или парные.

Подвижные с полярно расположен-i ными жгутиками.

Спор нет.

Окрашиваемость по Граму - отрицательная .

Кислотоустойчивость - отрицательная .

Рост бактерий на различных культуральных средах:

На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при 37с в течение 3 дн,, колонии клеток крулой формы диаметром 3-4 мм с шероховатой поверхностью, дольчатыми, разделенными на лопасти, краями (кромками) и молочно-желтовато-белой окраской, меловые, полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные.

На чашках Петри с меАнолсодержащим агаром - интенсивный рост при 37°С в течение 5 дн., колонии клеток диаметром 3-4 мм, выпукло-выступающие с глубоким пупком (углублением в центре), грубая, шероховатая поверхность, цельные края, опалесцирующий молочно-белый цвет и блестящий глянец, полупрозрачные и слизеподобные.

На скошенном питател -ном агаре нитевидный рост при 37 С в течение З дн., колонии клеток имеют гладкую поверхность и умеренно выступающую (.выпуклую форму, волнообразные или дольчатые (разделенные на лопасти края, молочный желтовато-белый цвет с тускловатым блеском, полупрозрачные и слизеподобные.

На скошенном метанолсодержащем агаре - нитевидный рост при в течение 5 дн., колонии клеток имеют ровную, гладкую поверхность и умеренно выступающую (выпуклую) форму, края цельные, молочно-опалесцирующий цвет и блестящий глянец, полупрозрачные и слизеподобные.

На питательном бульоне - умеренный рост при 37С в течение 3 дн. , не образуется никакого осадка или отстоя, на поверхности образуется пелликула.

На встряхиваемом питательном бульоне - интенсивный рост при 37С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная (просвечивающая).

На пептонном водном бульоне (встряхиваемом) - интенсивный рост при в течение 3 дн,, культура становится мутной, образуется осадок.

На метанолсодержащем бульоне интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн,, культура становится мутной, образуется осадок (отстой), на поверхности образуется кольцеобразная пелликула , полупрозрачная .

На метанолсодержащем бульоне (встряхиваемом)- интенсивный рост при в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок (отстой), полупрозрачная.

На питательном бульоне (палочковом) - рост на поверхности или пртекающий в глубину на 1-3 мм при в течение 3 дн. , поверхность имеет молочный желтовато-белый цвет

На питательном желатиновом бульоне (палочковом) - поверхностный рос при 30°С в течение 5 дн., с образованием осадка, желатин расжижается.

На лакмусовом молоке - при 37 С культура коагулирует.

Биохимические признаки:

Нитраты восстанавливает.

Реакция денитрификации - отрицательная.

Ретикулярная реакция (в мальпигивых тельцах) - отрицательная (MR-тес

Vl-тест - положительная реакция.

Индол не продуцирует.

Сероводород не продуцирует.

Крахмал гидролизует.

Утилизирует цитрат (среда Козера

Усваивает неорганический азот.

Ассимилирует аммонийные соли, нира ты.

fJe продуцирует пигмент (среды А jd В Кинга) .

Уреазная реакция - положительная

Каталазная реакция- - положительн а я .

И1)терва/ Ь температуры и рН для роста бактерий данного щтамма на ме1анолсодержащем бульоне ваоьируются (рН регулируют путем добавления водного раствора гидроокиси натрия или соляной кислоты). Наблюдается хороший рост при рН от 6 до 9. При рН 5 и 10 не наблюдается никакого pocid. Хоро:)ий рост в диапазонй

температур от 5 до . При 41 С никакого роста не происходит.

0-F тест (по методу Хьюго Лейфсо на). - окислительно метаболйзирует глюкозу.

Отношение к кислороду - аэробная культура.

Продуцирование кислоты и газа из Сахаров (при использовании пелто иной воды, содержащей сахар в.|{он центрации 1%, при 37 С в течение 10 дв.) представлено в табл. 3 .

Т а б л и ц а 3 Л-Арабиноэ Д-Ксилоза Д-Глюкоза д-Манноза Д-Фруктоза д-Галактоэ Мальтоза Сахароза Лактоза .Трегалоза Д-Сорбит Д-Маннит Инозит Глицерин Крахмал АССИМИЛ вании саха танолсодер рации 0,5 10 дн.) по Л-Арабино Д-Ксил03а Д-Глюкоза Д-Манноза Д-Фруктоз Д-ГалакТо

Продолжение табл. 4 Штамм выделен-из почвы. Метанолсодержащая агаровая среда использовавшаяся в тестах по культивации бактерий указанного штамма, имела следующий состав, мг: КН2РО . Na2KP04 (NH4),iS04 MgSO. - THzO CaCli- 2H20 FeS04- 7H20 ZnSQ,- 7HjO . 1,4 0,25 СиЗОд-SHjO 0,24 NaaMo04 CoCli- 0,24 1,2; MnSQd- SHj-O 20000 Arap Дистиллированная вода. Культуральную. среду стёрйлизрва ли при 120С в .течение 15 МЙй после чего добавили в асептических условиях 20 г,метанола. Для получения мётанолсодержащего бульона приготовили аналогичную среду, но $ ее составе совсем не использовали агар и количество метанола сократили до 5 г. Штамм Flavobacterium methanolicola DS-16 (FERM-P №4098). . Морфологические признаки; Штамм культивировали на питательном бульоне или питательной агаровой среде при 37°С в течение 3 дн. форма.и размер клеток - палочки от 0,5-0,7 до 1,5-1,8 мк. Колонии клеток единичные или парные.. , Подвижности нет. Спор нет.. Окрашиваемость по Граму - отриательная. Кислотоустойчивость - отрицательая. РОСТ бактерий на различных куль-у уральных средах1 На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при З7с в течение 3 дн., колонии клеток имеют круглую форму диаметром 4-5 выпуклые, однородная, равномерная структура, гладкая поверхность, края целые, окраска желтовато-кори невая, блестящая, полупрозрачная (просвечивающая) и слизеподобная На чашках Потри с метанолсодержаишм агаром - интенсивный рост при ЗТС в течение 5 дн., колонии клеток имеют круглую форму диаметром 2-3 мм, выпячивание носит хара тер выпуклости, гладкая ровная поверхность, целые края, молочный желтовато-белый цвет И блестящий г нец, полупрозрачная и слизеподобная. На скошенном питательном агаре нитевидный рост при в течение 3 дн., колонии клеток имеют умерен выступающую форму с шероховатой по верхностью и целой кромкой, желтовато-коричневые блестящие, полупро зрачные и слизеподобные. На скошенном метанолсодержащем агаре - нитевидный рост при в течение 5 дн. , колонии клеток ум ренно выпяченные (выступающие) с гладкой поверхностью и целой кромк молочно-желтовато-белые, блестящие полупрозрачные (просвечивающие) и слизеподобные. На питательном бульоне - умерен ный рост при в течение 3 дн. , образуется осадок, на поверхности образуется пелликула. На питательном бульоне (встряхиваемом) - интенсивный рост при в течение 3 дн., культура ста новится мутной, образуется осадок, полупрозрачная. На пептонной воде (встряхиваемой) - интенсивный рост при в течение 3 дн.у, культура становится мутной, образуется осадок. На метаноЯ :одержащем бульоне интенсивный jjc ст при З7с в течени 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, на поверхности об разуется кольцеобразная пелликул полупрозрачная, На метанолсодержащем е/льоне (встряхиваемом) - интенсивный рост при З7с в течение 3 дн. , культура становится мутной,.образуется осадок, полупрозрачная.На питательном бульоне (в виде столбиков) - рост на поверхности или протекающий до глубины 3-5 мм при 37°С в течение 3 дн. поверхп ность желтовато-коричневая. На питательном желатине (в виде столбиков; - при 3.0 С в течение 5 д не происходит никакого разжижения желатина. На лакмусовом молоке - при 37°С культура коагулирует. Биохимические признаки: Нитраты восстанавливает. Реакция денитрификации - положительная. Ретикулярная реакция (MR-тест) отрицательная. VP-тест - положительная реакция. . Продуцирует индол и сероводород. Крахмал гидролизует. Утилизирует цитраты (среда Козера), аммонийные соли, нитраты, неорганический азот. Не продуцирует пигмент (среды А и В Кинга). Уреазная реакция - положительная Оксидазная реакция - положительная. Каталазная реакция - положительная. Температуру и рН для роста бактерий на метанолсодержащем бульоне варьируют (рН регулируют путем прибавления водного раствора гидроокиси натрия или соляной кислоты). Хороший рост наблюдается при рН от 5 до 9 (предпочтительный диапазон рН б - 8), причем при рН 4 и 10 роста не наблюдается, и температуре в диапазоне от 15 до 40°С (температурный интервал от 25 до 40°с является предпочтительным), при 42°с роста не происходит. Отношение к кислороду - аэробная культура. 0-Р тест (по методу Хьюго Лейфсона) - окислительно метаболизирует глюкозу. Продуцирование кислоты и газа из сахаров (при использовании пептонной воды с концентрацией сахара 1 вес. % при в течение 10 дн.) риведено в табл. 5. Таблица 5 -f (слабое) Л-/ рабиноза Д-Ксилоза + (слабое) Д-Глюкоза + I слабое) Д-Манноза -t- (слабое) Д Фруктоза Д-Галактоза Мальтоза + (слабое) Сахароза Лактоза + (слабое) Трегалоза Продолжение т Д-Сорбит Д-Маннит Инозит Глицерин Крахмал Ассимиляция Сахаров (при зовании сахара .вместо метан метанолсодержащем бульоне в рации 0,5 вес. % при в ние 10 дн.) показана в табл Табли Сахара Ассими + X сл Л-Ара би но за Д-Ксилоза + (сл + (сл Д-Глюкоза + (сл Д-Манвоза + (сл Д- pyктoзa + (сл Д-Галактоза + (сл Мальтоза + (сл Сахароза Лактоза Трегалоза Д-Сорбит + (сл Д-Мг.ннит t (сл Инозит Штамм выделен из почвы. Метанолсодержащая агаров использовавшаяся в тестах п тивации бактерий указанного имела следующий состав, мг: 1500 Na2.HP04 3200 (Nh4)2.S04 3000 MgSQj- THjO 500 CaCla- 2hj.D 100 10 1, FeS04.УНаО ZnS04.- 7НгО CuSC.- SHjO 0, Ма2.МоОф- 2H,.0 0, CoCli- 0, МпЗОд- 1, 20000 Агар Дистиллированная вода Культуральную среду стер ли при в течение 15 м ле чего прибавили в асептических условиях 20 г метанола. Метанолсодержащий бульон имел аналогичный состав, но не исполь- зовали агар, а количество метанола сократили до 5г. Штамм Pseudomonas kyotoensis DS-22 (FERM-P 4099) . Морфологические признаки: Штамм культивировали на питательном бульоне и питательной агаровой среде при 37°С в течение 3 ди. Форма и размер клеток - палочки от 0,5 до 1,7-1,8 мк. Колонии клеток единичные или парные. Подвижные с полярно расположенными жгутиками. Спор нет. Окрашиваемость по Граму - отрицательная. Кислотоустойчивость - отрицательная. Рост бактерий на различных культуральных средах: На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при в течение 3 дн., колонии клеток .круглые диаметром 3-4 мм с ровной глакой поверхностью и цельными или волнообразными краями ( кромкой), молочножелтовато-белые, меловые, .полупрозрачные и слизеподобные. На чашках Петри С метанрлсодержащим агаром - интенсивный рост при 37 Св течение 5 дн. Колонии клеток круглые -диаметром 3-4,5 мм, выпуклой формы с шероховатой поверхностью и целыми краями, опалесцирующие меловые, полупрозрачные и слизеподобные. На скошенном питательном агаре нитевидный рост при З7с в течение 3 дн., колонии клеток умеренно выпяченные с гладков ровной поверхностью и целыми или волнообразными краями, молочно-желтовато-белые, меловые, полупрозрачные (просвечивающие ) и слизеподобные. На скошенном метанолсодержащем агаре - Нитевидный рост при 37С ,в течение 5 дн.., колонии клеток уме1енно выпяченные с шероховатой по- верхностью и волнообразными или дольчатыми разделенными на лопасти краями, опалесцирующие, наблюдается обраг зование бледно-розового пигмента, очень тусклый блеск (глянец), полуг прозрачные и слизеподобные. На питательном бульоне - умеренный рост при З7с в течение 3 дн,, образование-осадка не наблюдается, на поверхности образуется пелликула. Напитательном бульоне (встряхивание в процессе культивирования) интенсивный рост при в течение 3 дн.,культура становится мутной. наблюдается образование осадка, полупрозрачная . На пептонном водном бульоне (встряхивание в процессе культивиро вания) - интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок (отстой) . На метанолсодержащембульоне интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, на поверхности образуется тонкая пелликула, культура полупрозрачная. На бульоне, содержащем метанол в сочетании с минеральными солями (встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн. , культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная. На питательном бульоне (в виде столбиков) - при 31°С в течение 3 д рост происходит лишь на поверхности столбиков, поверхность молочно-желт го цвета. На питательном желатиновом бульо не (в виде столбиковJ - поверхностный рост при 30°С в течение 5 дн. с образованием осадка, желатин разжижает. На лакмусовом молоке при культура коагулирует. Биохимические признаки: Восстанавливает нитраты. Реакция денитрификации - отрицательная. Ретикулярная реакцияv(MR-тест) отрицательная. VP-тест - положительная реакция. Не .продуцирует индол и сероводород. Гидролизирует крахмал. Утилизирует цитраты (среда Козера), неорганический азот, аммонийны соли, нитраты. Не продуцирует пи-гмент (среды А и В Кинга). Не продуцирует пи Уреазная реакция - положительная Оксидазная реакция - положительная. Каталазная реакция - положительная. Температуру и рН для роста бактерий на метанолсодержащем ,е варьируют (рН регулируют путем добавления водного раствора гидроокиси натрия или соляной кислоты) . Хор ший рост наблюдается при рН от 5 до 9 (предпочтительный диапазон рН б - 8). При рН 4 и 10 роста не прои ходит. Хороший рост наблюдается при температуре в диапазоне от 5 до 45Су (предпочтительный диапазон 25 - 42С). При 48С роста нет. Отношение к кислороду - аэробная культура. 0-F тест (по методу Хьюго Лейфсона) - окислительно метаболизирует глюкозу. Продуцирование кислоты и газа из Сахаров (при использовании пептонной воды с концентрацией сахара 1 вес. I при в течение 10 дн.) представлено в табл. 7. Таблица 7 Л-Арабиноэа Д-Ксилоза Д-Глюкоза-f Д-Манноза4Д-Фруктоза+Д-Галактоза Мальтоза+ Сахароза . + ЛактозаТрегалоза++(слабое) Д-Сорбит Д- Маннит+ Инозит Глицерин+ Крахмал+ Ассимиляция Сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концент рации 0,5 вес.% при 37°С в течение Р дн.) показана в табл. 8. Таблица 8 -Ксилоза -Глюкоза -Ианноза + (слабая) -Фруктоза -Галактоза альтоза Продолжение Штамм вьщелен из почвы Метанолсодержащая агар использовавшаяся при пров тов по культивации, имела состав, мг: КНй.РО 1500 Na2HP04 3200 CNH4,)2 504 3000 MgS04- 7 Из О 500 2Н,0 100 10 1, FeS04 ZnS04- 7HZО CuS04-SHaO 0, Na2Mo04- 2112.0 0, CoCl. 0, 1, MuS04. SHiO 20000 « Агар Дистиллиро ванная вода Культуральную среду сте ли при в течение 15 ле чего прибавили в асепт условиях 20 г метанола. Метанолсодержащий буль аналогичный состав, однак дения агара, а количество сократили до 5 г. Штамм Pseudomonas aich DS-26 (FERM-P 4107). Морфологические призна Штамм культивировали н ном бульоне и питательной среде при 37С в течение Форма и размер клеток ют 0,3-0,4 до 0,75-1,0 мк Колонии клеток единичн ные. Подвижные с полярно ра ми жгутиками. Спор нет. Окрашиваемость по Грам тальная. Кислотоустойчивость ная . Рост бактерий на различных культуральных средах: На чашках Петри с питательным агаром - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн., колонии клеток круглой формы диаметром 4-6 мм с выпуклым выпячиванием горбообразной Формы, гладкой поверхностью и целыми или дольчатыми разделенными на лопасти краями, молочные, желтоватобелые, блестящие, полупрозрачные и слизеподобные. На чаинках Петри с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост при , 37°С в течение 5 дн., колонии клеток круглые диаметром 2-3 мм с глад- кой поверхностью и целыми краями, опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные и слизеподобные. На скошенном питательном агаре нитевидный рост при ЗТС в течение 3 дн., колонии клеток умеренно выпяченные с гладкой поверхностью и целыми или волнообразными краями, молочные, желтовато-белые, блестящие , полупрозрачные (просвечивающие и маслянистые. На скошенном метанолсодержащем агаре - нитевидный рост при в течение 5 дн., колонии клеток умеренно выпяченные (выпуклые) с гладкой поверхностью и целыми краями, опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные и маслянистые. На питательном бульоне - интенсивный рост при 37°С н течение 3 дн. наблюдается образование осадка,культура полупрозрачная, на поверхности образуется пелликула. На питательном бульоне (встряхивание в процессе культивирования) - ин тенсивный рост при 37°С в течение 3 дн,, культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная. На пептонном водном бульоне (встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок (отстой). На метанолсодержащем бульоне - интенсивный рост при З7с в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, -на поверхности образуется тонкая кольцеобразная пелликула, полупрозрачная. На метанолсодержащем бульоне (встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37 С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная. На питательном бульоне (в виде столбиков) - рост на поверхности или протекагоьщй до глубины 2-3 мм при 37С в течение 3 дн. , поверхность молочно-белого цвета. На питательном желатиновом бульоне (в виде столбиков) - поверхно стный рост при в течение 5 дн., с образованием осадка, желатин раз.жижает,- На лакмусовом молоке при ЗУ С культура коагулирует (свертывается) .. Бкохимические признаки: Нитраты не восстанавливает. Реакция денитрификации - отрицательная. Ретикулярная реакция (MR-тест) отрицательная. VP-тест - положительная реакция. Не продуцирует индол, сероводород Крахмал гидролизует. Не утилизирует цитраты (среда Козера). Утилизирует неорганический азот, аммонийные соли. Азотнокислые соли (нитраты) не. утилизирует. Пигмент не продуцирует (среды А и В Кинга). Уреазная реакция - положительная. Оксидазная реакция - положительная. Каталазная реакция - положительная. Температуру и рН для роста бактерий на метанолсодержащем бульоне варьируют (рН регулируют путем добавления водного раствора гидрооки- ,„ си натрия или соляной кислоты). Рост хороший при рН от 5 до 9. При рН 4 и 10 роста не происходит. Рост .хо- . роший при температуре в диапазоне от 5 до 45С (предпочтительный диа-цазон 25 - ). При роста не 35 наблюдается... Отношение к кислороду - аэробна культура. 0-F тест (по. методу Хьюго.Лейфсона) - глюкоза- не метаболизируетс ни в аэробных, ни в анаэробных усл виях (не отмечается никаких призна ков образования кислоты и газа). Продуцирование кислоты и газа и Сахаров (при использовании пептонной воды с концентрацией сахара 1 вес.% при 37С в течение ;10 дн.) показаны в табл. 9. Таблица 9 + (слабое) Л-Арабиноза Д-Ксилоза + (слабое) Д-Глюкоза + (слабое) Д-Манноза f 15 20 25 Продолжение табл. 9 + (слабое) Д-Фруктоза Д-Галактоэа мальтоза + (слабое) Сахароза Лактоза 4- (слабое) Трегалоза д-Сорбит Д-Маннит Инозит Глицерин Крахмал Ассимиляция Сахаров (при использовании сахара вместо метанола в метанолсодержащем бульоне в концентрации о 5 вес. % при 37°С в течение 10 дн.) представлена в табл. .10. Таблица 10 -:- Ассимиляция +(очень слабая) Л-Арабиноза +(очень -слабая) Д-Ксилоза 4-(очень слабая) Д-Глюкоза +(очень слабая) Д-Манноза +(очень слабая) Д-Фруктоза +(очень слабая) Д-Галактоза +(очень слабая) Мальтоза +(очень слабая) Сахароза Лактоза + (очень слабая) Трегалоза Д-Сорбит + (очень слабая) Д-Маннит + (слабая) Инозит + (очень слабая) Глицерин Крахмал Штамм Выделен из почвы

Метанолсодержащая агаровая среда

использовавшаяся вопытах { тестах) по культивации, имела следующий состав, мг:

КН2Р04.1500

NaahP043200 5

(NH4)2S043000

MgSOx THgO500

CaCl2-2H2 0100

FeS047H2010

2п504-7Н,0 .1,4 10

СиЗОд.ЗНдО0,25

Na Mo04- 2Н,,00,24

CoCl.- ,24

MnS04- 5H2.01,2

Агар20000 s

Дистиллированная вода1л

Культуральную среду стерилизовали при в течение 15 мин, после чего прибавили в асептических уело- 20 ВИЯХ 20 г метанола.

Метанолсодержащий бульон имел аналогичный состав, но не использовали агар, а количество метанола сократили до 5 г.25

Штамм Corynebacterium yamanasiensis DS-31 (FERM-P № 4106).

Морфологические признаки:

Штамм культивировали на питательном бульоне и питательной агаровой зО среде при течении 3 дн.

Форма и размер клеток - короткие палочки от 0,5-0,6 до 0,6-0,9 мк

Колонии клеток единичные или парные, а.также плеоморфные или изогну- тые и V-образные отдельные (разделенные) клетки.

Подвижности нет.

Споры отсутствуют.

Окрашиваемость по Гриму - поло- i жительная.40

Кислотоустойчивость - отрицательная.

Рост бактерий на различных культуральных средах:

На чашках Петри с питательным ага-45 ром - интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн. Колонии клеток круглые диаметром 2-2,5 мм с выпуклостью или горбом, с гладкой ровной поверхностью и целыми краями, желтые, блес-,Q тящие, полупрозрачные и маслянистые.

На чашках Петри с метанолсодержащим агаром - интенсивный рост при 31°С в течение 5 дн., колонии клеток 5 круглые диаметром 2-3 мм с гладкой поверхностью и целыми краями, опалесцирующие, блестящие, полупрозрачные и маслянистые.

На скошенном питательном агаре - 60 нитевидный рост при 37°С в течение 3 дн., колонии клеток умеренно выпяченные (выпуклые) с гладкой поверхностью и целыми краями, желтые, блестящие, полупрозрачные и маслянистые. 5

На скошенном метанолсодержащем агаре - нитевидный рост при 37С в течение 5 дн., колонии клеток умере но выпяченные с гладкой поверхностью и целыми краями, опалесцирующие, блестящие (глянцевитые), полупрозрачные и маслянистые.

На питательном бульоне - роЙг умеренный при 31°С в течение 3 дн., образуется осадок, культура слегка полупрозрачная, на поверхности не образуется пелликул.

На питательном бульоне (встряхивание в процессе культивирования) интенсивный рост при 37С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, полупрозрачная.

На пептонном водном бульоне - интенсивный рост при З7с в течение 3 дн,, культура становится мутной, образуется осадок.Культура на метанолсодержащем бульоне - интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн., культура станвится мутной, образуется осадок, на поверхности образуется тонкая кольцеобразная пелликула, культура полупрозрачная (просвечивающая).

На метанолсодержащем бульоне (встряхивание в процессе культивирования) - интенсивный рост при 37°С в течение 3 дн., культура становится мутной, образуется осадок, культура полупрозрачная.

На питательном бульоне (на столбиках или палочках) - рост на поверности или протекающий до глубины порядка 2-3 мм при 37°С в течение 3 дн., поверхность опалесцирующая.

На питательном желатиновом бульоне (на столбиках желатины) - поверхностный рост при 30°С в течение 5 дн. с образованием осадка, разжи||Жения желатины не происходит.

На лакмусовом молоке - при 37С культура коагулирует.

Биохимические признаки :

Восстанавливает нитраты.

Реакция денитрификации - положительная.

Ретикулярная реакция (MR-тест) положительная.

VP-тест - положительная реакция.

Не продуцирует индол, сероводоро

Крахмал гидролизует.

Утилизирует цитраты (среда Козера), аммонийные соли, азотнокислые соли (нитраты).

Не продуцирует пигмент (среды А и В Кинга).

Уреазная реакция - отрицательная

Оксидазная реакция - отрицательная.

Каталазная реакция - положительная.

Температуру и рН для роста бактерий на метанолсодержащем бульоне варьируют (рН регулируют путем добаления водного раствора соляной кис ты или гидроокиси натрия). Хороший рост- наблюдается в диапазоне рН от до 9, при рН 5 и 10 рост отсутству Хороший рост наблюдается при темпе туре в диапазоне от 5 до 41° С (пре почтительно в интервале 25 - ) При 42°С роста не происходит. Отношение к кислороду - аэробна культура. 0-F тест (по методу Хьюга Лейфсона) - глюкоза не метаболизируетс ни в аэробных, ни в анаэробных условиях (не наблюдается никаких при наков образования кислоты и газа). Продуцированиекислоты игаза и Сахаров (при использовании пептонной воды, содержащей сахар в конце рации 1 вес. %, при в течение 10 дн.) показано в табл. 11.. т а б л и ц а 1 Л-Арабиноза- ; Д-Ксилоза- . fl-rjaoKO3a+ Д-Манноза+Д-Фруктоза+ Д-Галактоза. + Мальто.за . ., + Сахароза+ Лактоза+ - Трегалоза+ (слабое) Д Сорбит Д-Маннит - Инозит Глицерин +. : - j..--.-... Ассимиляция Сахаров (при исполь зовании сахара вместо метанола в метанолсояержащем бульоне в концен рации 0,5 вес,% при З7с в течение 10 дн.) приведена в табл. 12. г а б л и ц а 1-2 Ассимиляция Л-Арабиноза + (слабая) -Ксилоза Продолжение табл. 12 Ассимиляция + (слабая) Д-Глюкоза + (слабая) Д-Манноза + (слабая) Д-Фруктоза + (слабая) Д-Галактоза + (слабая) Мальтоза + (слабая) Сахароза + (слабая) Лактоза Трегалоза + Д-Сорбит Ч- (слабая) Д-Маннит Инозит + (слабая) Глицерин .Крахмал Штамм выделен из почвы. Метанолсодержащая агаровая среда, использовавшаяся в опытах (тестах) по культивации бактерий данного штамма, имела следующий состав, мг: 1500 NaaHP04 3200 (NH4)iS04 3000 MgS04 500 . СаС1г ZHjO 100 10 1,4 FeS04. HjO ZnS04-7HzO CuS04-SHzO 0,25 NaiMo04- ZHjO 0,24 CoCl.j.- СНбО 0,24 MnS04 1,2 20000 Агар Дисти1й1рованная вода Культуральную среду стерилизовали при в течение 15 мин,после чего прибавили в асептических условиях 20 г метанола. Метанолсодержащий бульон имел аналогичный состав, но не содержал агара, а количество метанола составляло 5г. ЭксЬерименты проводили в соответствии с Руководством Бержи по определительной бактериологии (Вегвеу Manual of Determinative Bacteriology) (8-е изд., 1974 г.), Руководством по практической бактериологии (.издано Ассоциацией Выпускников Института Медицинской Науки, исправленное и дополненное издание Руко водства опублик. в 1975 г, изд-вом ,Марузен Компани Лтд.) и монографие Систематика и определение микроорганизмов (Taxonomy and Determina on of Microorganisms) Такейи Хасе гава (1975 г., Изд-во Токио Универ сити Пресс). Процесс культивирования вели в жидкой среде в аэробных условиях при 5 - (предпочтительно 25 43С), рН 5 - 9 (предпочтительно 6-8) периодическим или непрерывным способом. Метанол используют в качестве ос новного источника углерода в культуральной среде, при этом предпочти тельное количество его.составляет н более 50 г/л. . В качестве источников азота используют неорганические вещества, такие как аммонийные соли и нитраты и органические вещества, такие как мочевина, казеин, жидкий кукурузный экстракт, пептон, дрожжевой и мясной экстракты. Источниками фосфора являются соли фосфорной кислоты (фосфаты), а в качестве полезных источников серн используют различные соли серной кислоты -(сульфаты) В качестве источников металлов, не.обходимых для культивирования микро организмов, таких как магний, калий кальций, натрий, железо, марганец, медь, цинк, молибден, кобальт и бор в культуральную среду вводят соответствующее количество солей указанных металлов. в случае необходимости в культуральную среду добавляют также и другие вещества, требукяциеся . для роста микробных клеток, такие как витамины или аминокислоты, а также вещества, стимулирующие рост микроорганизмов . Величину рН культуральной среды регулируют путем введения фосфата и аммиака. Выделение (извлечение)микробных клеток из культуральной среда осуществляют обычным образом, например путем фильтрации, центрифугирования и т.д. с последующей промывкой и су кой биомассы микроорганизмов. Согласно предлагаемому способу .метанол, выпускаемый химическойjnpo мыишенностью, может 6ыть утилизйр6- ван как основной источник углерода микробными клетками ряда штаммов, принадлежащими к Flavobacterium tasaensis, Pseudomonas wakayamaensis, Flavobacterium methanolicola, Pseud monas kyotoensis, Pseudomonas aichi ensis, Corynebacterium yamanasiensi которые можно получать в больших ко личествах и с хорошим выходом. Поскольку получаенгые микробные клетки содержат значительное количество белковых веществ { протеинов ), их можно использовать не только в качестве кормовых или пищевых веществ, но также в качестве веществ медицинского назначения и технических материалов . Пример. Состав (рецептура ) культуральной среды, мг; 1500 КН4Р04 3200 3000 (NH4.)eS04500MgS04.- 100 20 2,8 CaCli FeS04 ZnSQ40,5 CuS04- 0,48 Na2.Mo04 2H2.0 2,4 MnS04.- Дистиллированная вода Культуральную среду поместили в склянку емкостью 1 л и стерилизовали при 120°С 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 5 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали (засевали 2 об.% предварительно полученной культуры, содержащей клетки Flavobacterium tosaensis DS-1 (FERM-P № 4058) , выращенной на среде, имевшей аналогичный основной культуральной среде состав, при З7с в течение 24 ч. Процесс культивирования проводили при 37°С в течение 20 ч в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне 7,0 путем прибавления 13 вес.% раствора аммиака. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения (выделения) микробных клеток. Клетки промыли водой и сушили при 24 ч. Получили высушенную биомассу в количестве .4,5 г/л культурального бульона. Время генерации (размножения) данной культуры в логарифмическом периоде роста составило 1,4 ч. Анализ полученной биомассы показал, что клетки содержат 80 вес. % скорого (неочищенного) белка. Пример 2. Культургшьную среду 1,2 л), имеющую состав, аналоК чный примеру 1f поместили в сосуд-ферментер емкостью 2,5 л и стерилизовали при 120°С 20 мин. Затем добавили в асептических условиях 12 г мета,нола. В полученную культуральную ередау внесли в качестве посевного материала { инокулята; 5 об.% предварительно приготовленной культуры, содержащей клетки Flavobacterium tosaensis DS-1 (FERM-P № 4058), полученной путем культивирования при в течение 20 ч на культуральной среде, имевшей состав, аналогичный примеру 1. Процесс культивирования проводили при З7с в условиях аьрации и перемешивания, поддерживая рй кул туральной среды на уровне 7,0 путем добавления 13 вес,% раствора миака. По-истечении 20 ч с начала процесса концентрация клеток в ку туральном бульоне составляла 4,5 К культуральному бульону добавлял водные растворы следующих солей м таллов, мл/л культурального бульо 10%-ный водный раствор дигидрофосфата калия (KHiPD4) 18 5%-ный водный раствор моногидрофосфата натрия ()77 10%-ный водный раствор сульфата магния (MgS04- 7Н2.0) . 18 10%-ный водный раствор хлористого кальция (CaCla.- ) 3,5 1%-ный водный .раствор сульфата двухвалентного железа (FeS047H O)5 1%-ный водный раствор сульфата цинка tZnS04- 7Н20)4 1%-ный водный раствор сульфата меди CUS04- )0,7 1%-ный водный раствор сульфата марганца ( ) 1,1 0,1%-ныйводный раствор борной кисло.ты (НзВОз ).2 О,1%-ный водный раствор хлористого кобальта ( 6Н 0) 0,5 По истечении 20 ч с начала кул тивирования в систему стали добав лять метанол таким образом, чтобы концентрация метанола в культурал ном бульоне поддерживалась на уро от 1 до 5 г/л. Количество метанол через 29 ч с начала процесса дост ло 96 г/л культурального бульона. По истечении 29 ч с начала культи рования культуральный бульон цент рифугировали с целью отделения микробных клеток. Полученную биомассу клеток промыли водой и суши ли при 25 ч. Получили 32 г высушенной биомассы клеток на 1 л культуральнрго бульона.,Анализ по казал, что эти клетки содержат 77 вес.% сырого белка (протеинов) Пример 3. Состав культуральной среды, мг: KHjPO 1500 Na 2HP043200 (NN4)5043000 MgS04 7Н20500 CaCliZH O100 FeS04. 7H-j,020 ZnS04- 7H.iO CuS04.- Na,2.Mo04 CoClz бНзО MnS04. SHjO Дистиллиров.анная вода 100 мл культуральной среды поместили в колбу Сакагучи емкостью 0,5 л и стерилизовали при 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 0,2 г метанола. В полученную культуральную среду внесли в качестве посевного материала (инокулята) 0,5 об.% прекультуры, содержащей клетки Pseudomonas wakayamaensis DS-25 (FERM-P № 4100), которая была получена культивированием при 35С в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей состав, аналогичный описанному, но количество метанола составляло 0,5 вес.%. Процесс проводили при 24 ч при встряхивании на качалке. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток. Выделенную биомассу клеток промыли водой и сушили при 100°С 24 ч..Получили 0,9 г высушенных клеток на 1 л культурального бульона. Время генерации (размнот жения) в логарифмическом периоде роста составило 1,5 ч. Анализ показал, что полученная биомасса клеток содержала-78 вес.% сырого белка (суммарных белковых веществ). Пример 4. 500 мл культуральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 3, поместили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали при 120С 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 5 г метанола. В культуральную среду внесли в качестве посевного материала (инокулята) 2 об.% культуры, содержащей клетки Pseudomonas wakayamaensis DS-25 (FERM-P № 4100), полученной путем предварительного культивирования при в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей аналогичный состав. Основной процесс культивирования проводили при 37С в течение 20 ч, поддерживая рН культуральной среды на уровне 7,0 путем прибавления 13 вес.% водного раствора аммиака. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью выделения микробных клеток. Клетки (биомассу) промыли водой и сушили при 100°С 24 ч. Получили 4,2 г высушенной клеточной биомассы на 1 .л кJ|Льтy- , рального бульона. Время генерации (размножения) указанной культк ры в логарифмическом периоде роста составило 1,6 ч. По данным анализа полученная клеточная биомас са содер100-мл культуральной среды помес .тили в колбу Сакагучи емкостью 0/5 и стерилизовали при 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 5 г метанола. В полученную кул туральную среду внесли вкачестве посевного материала 0,5 об.% культуры/ содержащей клетки Flayobacterium raethanolicola DS-16 (FERM-P 4098), которую приготовили путем культивирования При 35 G в течение 24 ч на культуральной среде, имевше аналогичный состав, но количество м танола составляло 0,5 об.%. Оснбв.ной процесс культивирования проводи ли при 24 ч. при встряхивании н качалке - - ; ч . , ; Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью выделения микробных клеток Клетки промыли : водой и сушили при 24 ч. Полу чили 0,85 г высушенной клеточной би массы на. 1 л культуральй1ого бульона : Время генерации .(размножения) культуры в период логарифмического роста составило 1/5 ч. По данным анализа содержание суммарных белков (сырное протеинов) в полученной сухой биомассе составило .75 вес.,%. П р и мер 6. 500 мл культурал ной бреды,имевшей состав, аналогичный примеру 5, поместили в.стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерил зовали при 120с 15 мин. -Затем доба вили в асептических условиях 5 г метаиола. S культуральную среду вне ли в качестве посевного материала (инокулята) 2 об.% культуры, содержащей клетки Flavobacterium methano.licola DS-16(FERM-P № 4098), полу ченной в результате культивации при в течение 24 ч на культуральной среде имевшей аналогичный состав. Основной процесс культивирования проводили при 37 С 20 ч в условиях аэрации и перемешивания, поддерживая рН культуральной сре ды на уровне 7,О путем добавления ..13 вес. % водного раствора аммиака. Полученный культуральный бульон цен

рифугировали с целью отделения микробных клеток. Клетки промыли водоЯ и сушили при 24 ч. Получили 4,2 г высушенной клеточной биомассы на 1 л культурального бульона. Время генерации (размножения) данной культуры в период логарифмического роста составило 1,6 ч. Содержа|А1е суммарных белков (протеинов) составило около 78 вес.%.

Пример 7. Состав культуральной среды, мг: / КНгР04 NazHPQt (NH4) MgS04. CaClx-2HiO FeS04.7H20 InSO -lHiO CuS04 . 0,5 Na Md04 0,48 CoCla 0,48 MnS04. 5H2.0 2,4 Дистиллирс ванная вода 500 мл культуральной среды помес тили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали, при 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 5 г метанола.. Полученную культуральную среду .инокулировали 2 об..%,культуры, содержащей клетки Pseudomonas kyotoensis DS-22(FERM-P № 4099), полученной в результате культивации при 37С в течение 23 ч на культургшьной среде, имевшей аналогичный состав. Основной процесс культивирования проводили при 37°с в течение 20 ч в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне добавления 13 вес.% водного раств:ора аммиака. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения (выделения) микробных клеток. Клетки промыли водой и сушили при 24 ч. Получили высушенную клеточную биомассу в количестве 4,3 г на 1 л культурального бульона. Время генерации (размножения} данной культуры в период логарифмического роста составило 1,5 ч. Полученная кле очная биомасса содержгьла 79 вес.% суммарных неочищенных белков. Пример 8.1,2л культуральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 7, поместили в стеклянный ферментер емкостью 2,5 л и -стерилизовали при 120С 20 мин, после чего добавили в асептических условиях 12 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали путем внесения в качестве посевного материала 5 об.% культуры, содержащей микробные клетки Pseudomonas kyotoensis DS-22 (FERM-P 4099) приготовленной путем культивирова ния при в течение 24 ч на ку туральной среде, имевшей аналогич ный состав. Основной процесс куль вирования проводили при ЗТ С в ус виях аэрации и перемешивания куль ральной среды, рН которой поддерж вали на уровне 7,О-путем использо ния 13 вес. % водного раствора ам ака. По истечении 20 ч с начала п цесса концентрация клеток в. культуральном бульоне составляла 4,3 К культуральному бульону добав ли следующие водные растворы соле металлов, мл/л бульона: 10%-ный водный раст- . вор дигидрофосфата калия (KHgPO )18 5%-ный водный раствор динатрийгИДрофосфата (Na,j,HPQ,j ) -77 10%-ный водный раствор сернокислого магния (MgS04. ) 18 10%-ный водный раствор хлористого кальция (CaCli ) 3,5 1%-ный водный раствор сернокислого железа (;ре504- ) 5 1%-ный водный раствор сернокислого цинка (2nS047H20) 3 1%-ный водный раст .. вор. сернокислой . меди ( ) 0,6 1%-ный водный раствор сернокислого марганца (MnS04- )0,7 О,1%-ный водный раствор борной кислоты (HjBO)2 Спустя 20 ч после начала культ вирования в культуральную систему бавили метанол таким образом, что его концентрация в культуральном бульоне сохраняласБ на уровне 1 г 5 г/л. Общее количество метанола, введенного в культуральную систем к концу 32 ч после начала гроцесс культивирования достигло 92 г/л кул турального бульона. По истечении с начала процесса культивирования культуральный бульон центрифугиро вали с целью отделения микробных клеток. Клетки промыли водой и су шили при 24 ч. Получили 31 высушенной клеточной биомассы на 1 л бульона. Анализ показал, что полученная клеточная биомасса сод жит 78 вес.% неочищенных суммарны белков (протеинов). . Пример 9. Состав культур ной среды, мг: КНаРОд 1500 NazHPQi 3200 (NH4)z ЗОд 3000 MgS04УН О 500 CaCla,- 2Н2.0 100 20 2,8 РеЗОд 7Н20 ZnS04- 7Н20 7Н20 0,5 NazMo04 0,48 CoCli- 0,48 2,4 MnS04. 5H,j,0 Дистиллированная вода 100 мл культуральной среды поместили в колбу Сакагучи емкостью 0,5л и .стерилизовали при 120°С 15 мин. Затем добавили в асептических условиях 0,2 г метанола. В полученную культуральную среду ввели в качестве посевного материала 0,5 об..% культуры, солеожащей микробные клетки Pseudomonas aichiensis DS-26 (FERMrP № 4107) , приготовленной путем культивирования при 37°С в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей аналогичный состав, но количество метанола в системе изменили до 0,5 вес.%. Основной процесс Культивирования проводили при 37С в течение 24 ч при встряхивании ферментационной колбы на качалке. Полученный культуральный бульон и,ентрифугировали с целью отделения мик- робных клеток от культуральной жидкости. Полученную клеточную биомассу промыли водой и сушили при 100°С 24 ч. Получили 0,88 г высушенной клеточной биомассы на 1 л культурального бульона. Время генерации (размножения) данной культуры-в период логарифмического роста составило 1,5 ч. Анализ полученной клеточной биомассы показал, что она содержит 79 вес.% суммарных неочищенных белков .. . Пример 10. 500 мл культуральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 9, поместили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали при 120°С 15 мин. Затем в культуральную систему ввели в асептических условиях 5 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали С засевали ) путем введения в нее в качестве посевного материала 2 об.% культуры, содержащей клетки Pseudomonas aichiensis DS-26 (FERM-P № 4107) , приготовленной путем культивирования при в течение 24 ч на аналогичной примеру 9 культуральной среде. Основной процесс культивирования проводили при З7с в течение 20 ч в условиях аэрации и перемешивания культуральной среды, рН которой поддерживали на уровне 7,0 путем введения 13 вес.% jpacTBopa аммиака. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения .микробных клеток от культуральной; жидкости. Полученную клеточную биомассу промыли водой и сушили при 24 ч. Выход высушенной клеточ ной биомассы составил 4,1 г на 1 л культурального бульона. Время генер ции данной культуры в период логари мического роста составило 1,6 ч. Ан лиз показал, что полученная клеточнал биомасса содержит 7 вес.% неочи щенных суммарных белков (протеинов) Пример 11. Состав культуральной среды, мг: 1500 NaaHP04 3200 CNH4.)2.S04 3000 500 MgS04-- 711-20 CaCli-2HiO 100 20 2,8 FeS047H20 ZnS04- 7H20 CuS04- SHjO 0,5 Na2.MoC4 ZHjO 0,48 CaClj.- 0,48 MnSO.- 5H.O 2,4 Дистиллированная вода 100 мл культуральной среды поместили в ферментационную колбу Сакагучи емкостью 0,5 л и стерилиз вали при 120С 15 мин. Затем ввели в асептических условиях 0,2 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали введением 0,5 об.% прекультуры, содержащей клетки Corynebacterium yamanasiensis DS-31 (FERM-P № 4106), которая была получена культивированием ука занного щтамма при 35°С в течение 24 ч на культуральной среде, имевш.ей аналогичный указанному состав, но количество введенного в систему метанола изменили до 0,5 вес.%. Ку тивирование проводили при встряхивании ферментационной колбы на качалке при 35°С в течение 24 ч. Полученный культуральный бульон цент рифугировали с целью отделения мик робных клеток от культуральной жид кости. Вьщеленную клеточную биомас су промыли водой и сушили при 10О 24 ч. Выход продукта составил 0,84 высушенной клеточной биомассы на 1 л культурального бульона. Время генерации (размножения } данной культуры в период логарифмического роста составило 1,5 ч. Анализ показал, что полученная биомасса микробных клеток содержит 76 вес.% не.очищенных суммарных белков (.протеинов). Пример 12. 500 мл культуг-. ральной среды, имевшей состав, аналогичный примеру 11, поместили в стеклянный ферментер емкостью 1 л и стерилизовали при 120°С 15 мин. Затем ввели в асептических условиях 5 г метанола. Полученную культуральную среду инокулировали путем введения в качестве посевного материал 2 об.% культуры, содержащей клетки Corynebacterium yamanasiensis DS-31 (FHRM-P № 4106), которую получили путем культивирования указанного штамма при в течение 24 ч на культуральной среде, имевшей состав, аналогичный указанному выше. Основное культивирование проводили в условиях аэрации и перемешивания культурального бульона при в течение 20 ч, поддерживая рН культурального бульона на уровне 7,0 путем использования 13 вес.% водного аммиака. Полученный культуральный бульон центрифугировали с целью отделения микробных клеток от культуральной жидкости. Выделенную клеточную биомассу промыли водой и сушили при 100°С 24 ч. Получили 4,0 г высушенных клеток на 1 л культурального бульона. Время генерации культуры в период логарифмического роста составило 1,6 ч. Анализ показал, что полученная клеточная биомасса содержит 77 вес.% неочищенных суммарных белков. Предлагаемый способ позволяет получить биомассу (содержание сырого протеина до 80% ) в количестве до 42,2% по метанолу в отличие от известного способа, в котором выход биомассы составляет до 40% (содержание сыроЛ протеина 70-80%). Результаты культивирования с использованием данных штаммов приведены в . табл. 13.

Результаты культивирования

Flavobacterium tosaensis DS-1 0,50939,0

Flavobacterium methanolf.cola

DS-160,59038,9

Pseudomonas wakayamaensis DS-25 0,4939,1

To же «

Pseudomonas kyotdensis Pseudomonas aichiensis

Corynebacterium yamana DS-31

Таблица 13

17,60,451

16,40,422

17,00,435

32,80,437

32,5.0,448

17,10,435

16,90,438

16,70,425