ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ HAEMOPHILUS PLEUROPNEUMONIAE Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/21 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для накопления клеточной массы с высоким содержанием капсульного вещества при выращивании вакцинных штаммов и при диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней.

В настоящее время одной из причин крупных экономических потерь свиноводства на промышленной основе являются болезни, вызываемые гемофильными бактериями гемофилезы, в частности гемофилезная плевропневмония свиней. Она регистрируется во многих странах с развитым промышленным свиноводством различных географических зон мира, и все чаще диагностируется в качестве причины смерти и уменьшения продуктивности животных. В связи с этим возникает необходимость в изготовлении диагностических препаратов и вакцин против этой болезни, что связано с решением вопроса получения больших количеств биологически полноценной бактериальной массы. Для ее приготовления необходимы жидкие питательные среды, составленные с учетом ростовых потребностей микроорганизма.

Для интенсивного роста возбудитель гемофилезной плевропневмонии свиней, помимо наличия в среде дифосфопиридиннуклеотида (ДПН), нуждается в аминокислотах, белках, липидах, углеводах, витаминах и микроэлементах. Кроме того, рост микроорганизма происходит ускоренно при постоянном перемешивании, т. к. при этом улучшается контакт клеток с компонентами питательной среды, и при ее принудительной аэрации, что повышает интенсивность обменных процессов клетки и снижает накопление в культуральной среде недоокисленных продуктов обмена веществ.

Известна жидкая питательная среда для культивирования Н.pleuropneumoniae (Ветеринария, 1984,11, с. 30), имеющая состав: основа бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг и ДПН (синтетический препарат дифоссфоприридиннуклеотид) 10 мкг/мл. Чистый ДПН отечественной промышленностью не выпускается, но его можно заменить дрожжевым экстрактом в количестве 10 к объему бульона (там же). Подобные среды, содержащие минимум ростовых факторов, целесообразно применять для диагностических исследований, т.к. они не позволяют достичь высокого выхода биомассы.

Прототипом является среда (Бюллетень ВИЭВ, вып.57, 1985, с. 39), имеющая следующий состав: основа бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% добавки: сыворотка крови крупного рогатого скота 3% ДПН 10 мкг/мл (или дрожжевой экстракт 10%), глюкоза 0,4% (в пересчете на сухое вещество), железо сернокислое 7-водное 10 мкг/мл.

Сыворотка крови крупного рогатого скота стимулирует капсулообразование и предотвращает диссоциацию микроорганизма, служит источником нативного белка, сернокислое железо рост и размножение популяции бактерий при культивировании в реакторе при постоянном перемешивании и аэрации. Глюкоза служит источником углерода, энергии и вводится в состав среды через 3,0-3,5 ч от начала культивирования. К недостаткам питательной среды данного состава можно отнести ее сильное вспенивание при выращивании микроорганизма в режиме аэрации и медленное опадение образующейся пены, необходимость применения пеногасителей. Глюкоза вводится в состав среды не сразу, и в начале роста бактерии испытывают недостаток в энергетическом материале, что снижает выход биомассы. Выбранное соединение железа имеет неорганическую природу и поэтому требует определенных затрат энергии для преобразования его в форму, которая может быть усвоена микроорганизмом.

Сущность изобретения состоит в том, что жидкая питательная среда для культивирования Н.pleuropneumoniae, включающая бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% и исходной рН 7,8-8,0, дрожжевой экстракт, сыворотку крови крупного рогатого скота, глюкозу, препарат железа, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество проксанол-268, а в качестве препарата железа его комплексное соединение (ферамид) при следующих соотношениях компонентов,
Дрожжевой экстракт 15,8-18,6
Сыворотка крови крупного рогатого скота 0,3-3,5
Глюкоза 0,12-2,24
Ферамид 0,0015-0,0035
Проксанол-268 0,03-0,53
Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% и исходной рН 7,8-8,0 83,7485-75,1265
Культивирование возбудителя гемофилезной плевропневмонии свиней осуществляют в биологическом реакторе, в режиме постоянного перемешивания и аэрации. Предлагаемая среда содержит легкодоступное сырье и реагенты отечественного производства, проста в изготовлении, обеспечивает высокий выход биомассы. При культивировании в режиме постоянной аэрации образующаяся пена быстро разрушается и поэтому отпадает необходимость в применении пеногасителя. Под воздействием ингредиентов предлагаемой питательной смеси улучшается структура клеточных мембран, возрастает потребление веществ из питательного раствора, улучшается обмен веществ за счет непосредственного воздействия на ферментные системы клеток, окислительно-восстановительные процессы, предотвращается явление самоагглютинации бактерий на завершающих этапах культивирования, увеличивается устойчивость бактериальных клеток к резким колебаниям рН среды. Ингредиенты среды способны связывать бактериальные токсины и продукты клеточного обмена, обладают антикоррозионной активностью. Выбранное соединение железа обладает значительно большей биологической ценностью и легче усваивается. Кроме того, компоненты питательной среды в их оптимальном соотношении предотвращают образование плотного осадка при долгом хранении готовой продукции. Все вышеперечисленное позволяет получить биомассу с концентрацией бактериальных клеток значительно выше, чем при использовании среды прототипа, и с более высоким содержанием в ней клеток,окруженных капсулой,за тот же промежуток времени (6-8 ч).

Оптимальные концентрации компонентов определены опытным путем на основании анализа результатов их раздельного титрования, рН среды выбрана на основании изучения результатов экспериментов, с учетом того, что экстракт дрожжей имеет кислую реакцию (6,0-6,2), а введение в состав среды глюкозы в начале культивирования микроорганизма способствует быстрому закислению бульона.

Оптимальные концентрации экстракта дрожжей определены на основании графических анализов. При этом учитывали значение показателя экстинкции среды и выхода клеточной массы за 6 ч. Увеличение концентрации экстракта дрожжей от 0,3 до 15,8% стимулирует рост микроорганизма, а более 18,6% подавляет его. Наиболее высокие значения показателя оптической плотности (экстинкции) и выхода клеточной массы за 6 ч получены при содержании испытуемой добавки от 15,8 до 18,6%
Сыворотка крови крупного рогатого скота служит источником нативного белка, микроэлементов, витаминов, стимулирует образование капсулы, предотвращает диссоциацию. Анализ результатов показал, что с ростом содержания сыворотки крови величина оптической плотности культуральной среды возрастает, а выход биомассы снижается. Достаточный прирост бактериальной массы высокого качества получен при содержании сыворотки крови в бульоне от 0,3 до 3,5%
Компонент среды проксанол-268 способствует улучшению структуры клеточной мембраны, стимулирует клеточный метаболизм за счет воздействия на комплекс ферментов клетки, увеличивает объемы капсульных липополисахаридов, повышает устойчивость бактерий к резким колебаниям рН среды, замедляет старение культуры. Оптимальные концентрации этого компонента выбраны на основе графического анализа. Расчеты выхода биомассы показывают, что увеличение концентрации препарата от 0,03 до 0,95% стимулирует рост микроорганизма, а более 1,49% подавляют его. Достаточно высокий уровень выхода биомассы с наибольшим содержанием клеток, окруженных капсулой (более 90%), получено при содержании проксанола-268 от 0,03 до 0,53%
Оптимальные концентрации глюкозы также определены на основании графического анализа. В качестве показателей были выбраны: выход бактериальной массы, экстинкция среды, число клеток, окруженных капсулой. При содержании глюкозы от 0,12 до 2,24% содержание инкапсулированных клеток в биомассе превышало 90%
Ионы железа в составе питательной среды выполняют роль стимулятора роста. Оптимальные концентрации комплексного соединения железа ферамида - определены также на основании учета значений выхода бактериальной массы и содержания в 6-часовой культуре клеток, окруженных капсулой. Биомасса с высоким содержанием в ней инкапсулированных клеток (более 90%) может быть получена при содержании ферамида от 0,0025 до 0,0115% а наибольший ее выход - при 0,0015-0,0035% Совместив эти характеристики, выбрали оптимальные концентрации ферамида 0,0015 0,0035%
Пример. Жидкую питательную среду для культивирования H.pleuropneumoniae готовят следующим образом. Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% и исходной рН 7,8-8,0 (готовят из перевара Хоттингера путем его разбавления солевым раствором, содержащим 0,3% натрия хлорида, 0,1% калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,02% калия хлорида) дополняют проксанолом-268 (0,03% ), глюкозой (0,4%), комплексным соединением железа (0,0035%). После полного растворения реагентов смесь пропускают через бумажный фильтр и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм 20 мин. Хранят при 2-4^oC не более 10 суток. Готовую смесь (с соблюдением правил асептики) заливают в биологический реактор, соединяют с экстрактом дрожжей (16,7%), сывороткой крови крупного рогатого скота (2,9%), подогревают до 36-38^oC, засевают бактериальной суспензией из 6-8-часовой культуры вакцинного штамма с концентрацией 20 единиц мутности по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича, которую вносят в среду из расчета 1-100 млн м.т./мл ее объема. Содержимое реактора перемешивают 5 мин (скорость 240 об/мин). После этого мешалку отключают. Выращивание микроорганизма в стационарных условиях ведут 55-60 мин. С конца первого часа культивирование вакцинного штамма осуществляют в режиме постоянного перемешивания питательной среды и ее принудительной аэрации. Стерильный воздух в реактор подают с объемной скоростью 0,5-1,0 л/мин на 1 л питательного раствора. Через каждые 30-60 мин (после первого часа) из реактора отбирают образцы культуральной среды в количествах, достаточных для изготовления мазков, определения рН и концентрации бактериальных клеток в ней. Последнюю операцию осуществляют путем мерного разведения образца культуры 0,9%-ном раствором натрия хлорида и сравнения результата с оптическим стандартом на 10 единиц мутности ГИСК им. Тарасевича. Мазки окрашивают по Граму, используют для оценки чистоты бактериальной массы. Реакцию культуральной среды определяют при помощи иономера универсального. В процессе выращивания микроорганизма корректируют рН питательного бульона, поддерживая ее на уровне 7,2-7,4 при помощи стерильного 10%-ного раствора натрия гидрооксида. Через 3,0-3,5 ч после посева, в среду дополнительно вводят глюкозу из расчета 0,4% от исходного объема бульона. По истечении 1,5-2,0 ч указанную процедуру повторяют.

По окончании процесса выращивания (6-9 ч) проводят контроль чистоты полученной биомассы путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Одновременно с этим определяют концентрацию клеток в культуральной среде и ее рН. При соблюдении условий культивирования выход бактериальной массы составит около 25-30 млрд м.т./мл, а содержание в ней клеток, окруженных капсулой - 97-99%
Таким образом, использование среды нового состава позволяет получить бактериальную массу с высокой биологической ценностью. Она может быть использована при производстве вакцин для парентерального и аэрозольного применения. На этой среде можно осуществлять культивирование других ДПН зависимых гемофильных бактерий, возбудителя пастереллеза, сальмонеллеза и некоторых других.

Использование: микробиология, питательная среда для культивирования Haemophilus pleuropneumoniae, капсульное вещество, диагностика гемофилезной плевропневмонии свиней. Сущность изобретения: жидкая питательная среда состоит из смеси следующих компонентов: бульона Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% и рН 7,8-8,0, дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, глюкозы, проксанола-268 и ферамида, взятых в определенных количествах. На среде можно осуществлять культивирование ДПН-зависимых видов гемофильных бактерий, возбудителя пастереллеза, сальмонеллеза и некоторых других.

Жидкая питательная среда для культивирования бактерий Haemophiluse pleuropneumoniae, включающая бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% и исходной рН 7,8 8,0, дрожжевой экстракт, сыворотку крови крупного рогатого скота, глюкозу, препарат железа, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество проксанол-268, а в качестве препарата железа его комплексное соединение ферамид при следующих соотношениях компонентов, мас.

Дрожжевой экстракт 15,8 18,6
Сыворотка крови крупного рогатого скота 0,3 3,5
Глюкоза 0,12 0,24
Ферамид 0,0015 0,0035
Проксанол-268 0,03 0,53
Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% и исходной рН 7,8 8,0 Остальное