Способ получения диоксиацетона Советский патент 1980 года по МПК C12D1/00 C12D13/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИОКСИАЦЕТОНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения диоксиацетона при помощи иммобилизованных в полиак риламидном геле неразмножающихся кле ток Gluconobacter oxydans. Использование иммобилизованных ферментов и клеток является перспективным, так как дает возможность применять их в непрерывных автоматизированных процессах, а также в ря де случае позволяет упростить процес выделения продуктов микробиологического синтеза. Диоксиацетон (ДОА) в Советском Союзе не производится, однако извест ны широкие возможности его применения в лабораторных биохимических исследованиях, в парфюмерной, легкой и пищевой npoNbiiuneHHOCTH, а также в медицине. Известен способ получения диоксиацетона, заключающийся в том, что Диоксиацетон накапливается в процессе роста и размножения клеток Gluconobacter oxydans в богатой органическими добавками среде, содержащей глицерин, кукурузный экстракт, дрожжевую воду, монокалийфосфат и карСонат кальция в условиях аэрации. Пр цолжительность окисления глицерина растущими клетками бактерий составляет 30 ч. По окончании процесса бактериальную массу отделяют центрифуги-. рованием или сепарированием, а целевой продукт получают из культуральной жидкости l . Недостаток этого способа заключается в однократном использовании биомассы бактерий. Кроме того, выделение диоксиацетона затруднено из-за наличия в культуральной жидкости большого количества органических примесей, что являетбя следствием использования для процесса сложной по составу среды, Выделение диоксиацетона в таком случае процесс трудоемкий, включающий обработку культуральной жидкости адсорбентами, что приводит к большим потерям продукта. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения диоксиацетона путем выращивания продуцирующих бактерий Gluconobacter oxydans в усуювиях аэрации на питательной среде, содержащей глицерин, монокалийфосфат , дроюхевую и водопроводную воду с последующим отделением бактерий от питательной среды, окислением глицерина в диоксиацетон неразмножающимиая клетками бактерий и его выделением. Способ заключается в том, что на первой стадии процесса осуществляют выращивание бактерий при 28°С на среде, содержащей глицерин, монокалийфосфат и отвдр пекарских дрожжей, затем клетки бактерий отделяют центрифугированием от жидкой фазы и помещают в 5-8%-ный водный раствор глицерина, содержащий 0,2% моноксшийфосфата. Неразмножающиеся клетки бактерий в условиях аэрации интенсивно окисляют глицерин в диоксиацетон. Одну и ту же биомасс используют несколько раз, отделяя клетки бактерий центрифугированием, каждый раз по окончании процесса окиления глицерина 2 .

Недостатком этого способа является то, что каждый раз по окончании цикла микробиологической трансформации глицерина в диоксиацетон требуется отделение клеток от среды. Такое отделение процесс длительный и трудоемкий, требующий-использования дорогого оборудования и определенных энергозатрат на сепарацию, а также может способствовать появлению инфекции и приводит к потере биомасс

Цель изобретения - обеспечение непрерывности способа получения диоксиацетона, уменьшение потерь биомассы, а также сокращение энергозатрат на процесс получения диоксиацетона, т.е. упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем что окисление глицерина осуществляют предварительно иммобилизованными в полиакриламидном. геле клетками бактерий.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру бактерий G1uconobacter oxydans выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мп со 100 мл среды, содержащей б% глицерина, 0,2% монокалийфосфата,10 об.% 10%-ной дрожжевой воды и водопроводную воду. Выращивание ведут на круговой качалке при 28°С в течение 36 ч. Получен ную биомассу отделяют центрифугированием, клетки отмывают водой до исчезновения следов, редуцирующих веществ и используют для иммобилизации Далее клетки G1uconobacter oxydans иммобилизуют в полиакриламидный поперечноссштый гель, выбранный для работы потому, что он имеет ряд преимуществ перед другими гелеобразующиминосителями: нетоксичен для живых клеток, легко полимеризуется из раст воримых в воде соединений и хорошо гранулируется.

Включение бактериальных клеток в полиакриламидный гель проводят следующим способом.

Для получения геля используют водный раствор 9,5 г акриламида и 0,5 г g поперечносшивающего агента М,м-метиленбисакриламида, в котором суспендируют бактериальные клетки. Реакция полимеризации идет в присутствии катализаторов - 0,1 г персульфата аммО Q нйя и 0,1 г N,N,NN-тeтpaмeтилeндиамина при охлаждении до 12-15 с в атмосфере азота.Время реакции 1015 мин.Полученный блок геля с включенными в него клетками взвешивают, измельчают и продавливают через сито S с отверстиями 0,25 мм. Количество иммобилизованных бактериальных клеток (в пересчете на сухой вес) составляет 5-7% от веса геля-носителя.

Полученный по предложенному мето0 ДУ гель с включенными в него клетками используется для окисления глицерина в диоксиацетон.

Концентрация накопленного диоксиацетона определяется колориметричес5 КИМ методом с использованием хлорис-того трифенилтетразолия.

Окислительную активность (А) свободных и включенных в гель клеток вычисляют по формуле

д ДОА

- слт

где

Q. - количество образовавшегося ДОА, г; С - количество абсолютно сухой биомассы (СБ), г, ul - продолжительность окисления, ч.

0 Пример. Окисление глицерина в диоксиацетон иммобилизованными в полиакриламидном геле клетками G1uconobacter oxydans в, термос- атированных колонках с аэрацией и без аэрации. Через термостатированную колонку с гранулами геля пропускают среду, состоящую из водопроводной воды, 6% гли церина и 0,2% монокалийфосфата. Среду дюдают в колонку сверху из градуиро.ванной воронки со скоростью 9 мл/ч, 0 рн среды 5,0. Вытекающую из колонки . жидкость анализируют на содержание диоксиацетрна. В таких условиях клетки сохраняют жизнеспособность и окислительную способность до 10 сут. 5 В табл. 1 приведена окислительная активность иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток 61uconobacter oxydans в термостатированных колонках.

Колонка, на. полненная гранулами геля, без аэрации

Колонка, наполненнаягранулами с аэрацией микрокомпрессором

Данные табл. 1 показывают, что аэрация позволяет значительно увеличить окислительную активность иммо- билизованных клеток бактерий Gluconobac te г oxydans.

П«р и м е р 2. Окисление глицерина в диоксиацетон иммобилизованными клет200

О 1 2 3 4 200 200 200 200

Иммобилизованные

Таблица i

0,048

0,032

0,060

0,317

0,204

0,058

ками Gluconobacter oxydans В термостатированных сосудах с аэрацией.

В табл. 2 приведены данные по накоплению диоксиацетона свободными иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans в сосудах с аэрацией среды.

Таблица 2.

О

2,94

0,72

1,14 ,32

2,12

1,26 1,71

1,47 1,50

О 0,34

1,31

1,38

0,69

1,28 1,27 0,99 1,22 1,27

Как видно из табл. 2,за 4 ч свободные клетки накопляют 1,47% диоксиацетоиа, а иммобилизованные -1,27%. Средняя окислительная активность иммобилизованных клеток,в этих условиях составляет 60% от окислительной способности свободных клеток.

Данные табл. 1 и 2 показывают возрастание окислительной активности как иммобилизованных, так и свободных клеток при проведении опытов в термостатированных сосудах по сравнению с окислительной активностью данной культуры бактерий в колонках. Так, окислительная активность иммобилизованных клеток за 4-й час опыта в сосудах с аэрацией среды составляет 1Д1 , , а в колонках максимальная окислительная активность иммобилизованных клеток составляет

о.,„г

Однако и в термостатированных сосудах с аэрацией скорость абсорбции кислорода по-прежнему лимитирует процесс трансформации глицерина в диокси ацетон.

Пример 3.Окисление глицерина в диоксиацетон иммобилизованными клетАэрация воздухом10 0,116

Аэрация воздуxoMj обогащенным кислородом

Аэрация воздухом

Аэрация воздухом, обогащенным кислородом

Как видно иэ табл. 3, свободные и иммобилизованные в геле клетки реагируют на интенсификацию аэрации введением в опытные колбы обогащенного кислородом воздуха повышением окислительной активности, а именно свободные клетки при этом повышают окиС

ками G1uconobacteг oxydans и колбах на качалке с аэрацией обогащсзнным кислородом воздухом. Гранулы глея с включенными в них клетками помещают в колбы объемом 750 мл. Колбы встряJ хивали на качалке при 26°С. Интенсивность аэрации, выраженная сульфитным числом, в этих условиях составляет 1,5 г Ог/л ч при рабочем объеме в колбе 150 МП. Для окисления глицерина

.,j используют раствор, содержащий 60 г

глицерина и 2 г монокалийфосфата

на 1 л водопроводной воды. Колбы снабжены насадками, через которые с помощью масляного насоса откачивают возду до остаточного давления 40 мм рт.ст.

15 и заменяют кислородом. Заполнение колб проводят каждый час. Для контроля ведут опыты по окислению глицерина иммобилизованными и свободными клетками G1uconobacteг oxydans в колбах, закрытых ватными пробками, т.е. с аэрацией атмосферным воздухом.

В табл. 3 приведены данные по вли25 янияю аэрации на окислительную активность свободных и иммобилизованных клеток G1uconobacteг oxydans.,

Таблица 3

2,71

2,10

5,95

4,76

0,120

1,60

1,20

0,113

2,81

2,16

0,115

лительную активность с 2,71 до

,,,

т.е. в 2,2, раза, а иммобилизованные клетки повьлиают окислительную активность с 1,60 до

Л Q Д

этом в условиях аэрации воздухом окислительная активность иммобилизованных клеток составляет 59% таковой свободных клеток, а в условиях аэрации воздухом. Обогащенным кислородом окислительная активность иммобилизованных клеток составляет 47% от окислительной активности свободных клеток.

Следовательно, все три варианта опытов показывают принципиальную возможность микробиологической трансформации глицерина в диоксиацетон иммобилизованными в полиакриламидном геле клетками G1uconobacter oxydans как в непрерывном, так и в периодическом процессе.

Предлагаемый способ дает возможность получать диоксиацетон в непрерывном процессе.

Переход от периодического процесса производства к непрерывному с использованием иммобилизованных клеток бактерий позволяет в большей степени автоматизировать процесс, сократить затраты на заработную плату за счет высвобождения части промышленно-производственного персонала и устранения некоторых ручных вспомогательных операций.

Совершенствование технологической схемы, увеличение длительности использования биомассы и замена сепарирования культуральной жидкости отстаиванием при использовании включенных в гель бактерий позволяет сократить время производственного цикла

и уменьшить сумму капитальных затрат на производственное оборудование.

В результате внедрения предлагаемого способа ожидаемый экономический эффект при производстве диоксиацетона мощностью 30 т в год составляет /J,/0 тыс. руб. в год.

Формула изобретения

Способ получения диоксиацетона путем выращивания продуцирующих его бактерий Gluconobacter oxydans в условиях аэрации на питательной среде содержащей глицерин, монокалийфосфат У дрожжевую воду и водопроводную воду с последующим отделением бактерий от питательной среды, окислением глицерина в диоксиацетон неразмножающимися клетками бактерий и его выделением, отличающийся тем, что, с целью обеспечения непрерывности процесса, уменьшения потерь биомассы и упрощения способа, окисление глицерина осуществляют предварительно иммо5 билизованными в полиакриламидном геле клетками бактерий.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

0 1. Патент США 2948658, кл. 195-36, опублик. 1960.

2. Авторское свидетельство СССР № 427050, кл. С 12 D 1/00, 1972.