Штамм бактерий @ @ @ -20-продуцент глицеролдегидрогеназы,окисляющий глицерин в диоксиацетон Советский патент 1985 года по МПК C12N15/00 C12N9/04 C12P7/02 C12R1/02 

Изобретение относится к микробиологической промьгашености и представляет собой штамм культуры бактерий Gluconobacteroxydans D-20 для промьшшенного получения диоксиацетата, применяемого в пищевой промышленности и медицине. Известна культура бактерий Acetobacter aceti-npoдуцент глицеролдегидрогеназы, окисляющий глицерин в диоксиацетон lj ,

Наиболее близка к предлагаемой культурабактерий Acetobacter Suboxydans - продуцент внеклеточного фермента глицеролдегидрогеназы катализируюпрй окисление глицерина строго избирательно по вторичной гид роксильной группе в диоксиацетон. Бактерии G.oxydans хорошо развариваются на средах с глицерином, который как источник углерола обеспечивает осуществление их энергетических и синтетических процессов. Эта культура хранится в коллекции микроорганизмов биологического факультета Ленинградского государственного университета и является прототипом изобретения 2j .

Бактериальные клетки этой культуры имеют палочковидную форму, средние размеры клеток 0,5 - 1,2 мкм, размножаются делением, споры не образуют, склонны к образованию длинг ных цепочек. Бактерии-каталазоположительные облигатные аэробы. Ассимилируют глюкозу, лактозу, мальтозу, галактозу, глицерин, этанол, метанол пропанол и другие спирты. Характертернй особенность ассимилировать уксусную кислоту. Этот штамм используется для ползчения уксусной кислоты на спирте, глюконовой или котоглюконовой кислоты из глюкозы, сорбозы из сорбита. 1Чтамм способен окислять глицерин в концентрации не более 2% до диоксиацетона при температуре в течение 48 ч. Выход диоксиацетона - 98%, определенный по результатам анализа. Однако данный штамм не может найти промышленного применения для получения диоксиацетона в связи с его неспособностью окислять высокие концентрации глицерина (2%). В связи с этим процесс производства диоксиацетона с применением этого татамма является низкопроизводительным.

Целью изобретения является получение активного штамма G.oxydans.

способного окислять глицерин при концентрации последнего в среде 10-20%.

Данный штамм бьш вьщелен -селекционным путем воздействия высоких концентраций глицерина на исходную культуру бактерий G.oxydans, полученную из Ленинградского государственного университета.

Ниже приведена схема селекции штамма G.oxydans

Gluconobacter oxydans ЛГУ

Отбор на способность окислять

6% глицерина

Отбор на способность окислять

10% глицерина

Отбор на способность окислять

15% глицерина

Отбор на способность окислять

20% глицерина, штамм G.oxydans

.

Предлагаемый штамм отличается от исходного штамма не только значительно большей способностью окислять глицерин, но рядом морфологических и физиологических признаков.

Данный штамм хранится в коллекции Центрального музея промьшшенных микроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции под коллекционным номером В-2520,

Морфологические признаки.

Бактериальные клетки имеют палочковидную форму, средний размер клетки 0,6 X 1,2 X 1,6 мкм. Размножаются делением, спор не образуют, формирование цепочек наблюдается редко. Инволютные формы проявляются в виде сильно увеличенных клеток

На агаризованной. среде с глицерином образуют мелкие вьтуклые круглые гладкие блестящие колонии без пигментов. На поверхности жидкой среды через 24 ч образуют тонкую прозрачную полисахаридную пленку.

Физиолого- биохимические, свойства

Бактерии каталазоположительные, облигатные аэробы. Молодые клетки грамотрицательны.

Оптимальная температура для окисления глицерина до диоксиацетата - 28-30°С, рН 5,5. ;

Отношение к углеводам. Бактерии G.oxydans хорошо ассимилируют глюкозу, мальтозу, галактозу, раффинозу.

Отношение к спиртам. Ассимилируют глицерин, этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, изобутанол, пентанол, сорбит, маннит.

Отношение к уксусной кислоте. Не ассимилирует.

П р и м е р 1, Окисление глицерина в диоксиацетон проводят следующим образом. Для подготовки посевного материала суспензию клеток G.oxydans из одной пробирки (возраст культуры - одни сутки) в асептических условиях вносят в колбу Эрленмейера с четырьмя отбойниками объемом 750 мл, содержащую 50 мл посевной среды следующего состава, мас.%:

15,0

1,25 0,3 0,029 5,5-5,7

Выращивание посевного материала проводят в течение 16-20 ч при 30 С до содержания диоКсиацетона в среде 6,0-8,0%.

Посевным материалом в количестве 2% засевают среду для ферментации следующего состава, мас.%: .

Глицерин15,0

Кукурузный

3KCTpaKt

(50% сухих

веществ)0,63

KHjPO 0,5

рН среды 5,5-5,7

Ферментационную среду разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера четьфьмя отбойниками объемом 750 мп. Ферментацию осуществляют на качалке (180 - 200 об/мин) в течение 48 ч. Содержание диоксиацетона в среде 14,4 - 14,7%, что составляет выход 98-100% от теоретического.

П р и м е р 2. Для проведения ферментации в укрупненных лабораторных условиях посевной материал готовили следующим образом. Суспензию клеток односуточной культуры G.oxydans из одной пробирки вносили в колбу Эрленмейера емкостью 750 мл снабженную четырьмя отбойниками, содержащую 100 мл питательной среды следующего состава, мас.%:

20,0

Глицерин Кукурузньп экстракт (50% сухих веществ)

1,5 0,3

КН2Р04, 0,025 . MRSO

5,5-5,7

рН среды

Выращивание посевного материала осуществляют на качалке (180200 об/мин) при ЗО-с в течение 24 ч до накопления в среде 7,0-8,0% диоксиацетона.

Окисление глицерина в диоксиацетон проводят в ферментере емкостью 30 л (рабочий объем 20 л), имеющем сульфитное число, равное 10 г 02Л/ч .

Питательная среда для ферментации имела следующий состав, мас.%: Глицерин20,0

Кукурузный экстракт (50% сухих

веществ)0,75

KHjPO 0,5

рН среды5,5-5,7

После стерилизации и охлаждения среды до 30 С ее засевают посевным материалом в количестве 1%. Ферментацию осуществляют в течение 72 ч при . За это время окисление глицерина до диоксиацетона проходит на 96%, что составляет 3,75 кг диоксиацетона. Удельная производительность ферментера составляет 62,7 кг 100%-ного диоксиацетона с 1 м оборудования в сутки.

Удельная производительность ферментера рассчитывается по формуле

Wr-k П

Irt

где а - удельная производительность ферментера}

ff - количество глицерина,

взятого на окисление, кг} 1C - коэффициент перевода рабочего объема ферментера на 1 мJ

- выход диоксиацетона при

окислении глицерина, t - срок ферментации, сутки, 1,02 - коэффициент пересчета глицерина на диоксиацетон.

ПримерЗ.В производственных условиях посевной материал готовят в инокуляторе емкостью 10 л.

заполненном 6 л питательной среды, именнцей состав, как указано в примере 1.

Для засева инокулятора используют культуру G.oxydans , выращенную в колбе, как описано в примере 2.

Ферментер емкрстью 1 м (рабочий объем 600 л), снабженный якорной ме(цалкай, делающей 180 об/мин и обес«печивакицей аэрацию 1 объем воздуха на один объем среды в минуту. Производственная питательная среда для ферментагщи имеет состав, как указано в примере 1.

После стерилизации и последзпщего охлаждения среды до 30 С ее засеваю т посевным материалом из инокулятора. Ферментацию осуществляют в течение 72 ч. За это время окисление глицерина проходит на 94,5%. Удельная производительность ферментера(Составляет 47,5кг/ в сутки.

В таблице приведены сравнительные показатели предлага юго штамма с прототипом.

Таким образом, преимущество предлагаемого штa ttlaдля промышленного получения диоксиацетойа эакшочается в ув личеиии концентрациидиоксиацетона;,

Предлагаемый штамм позволяет получать культуральную жидкость, содержащую высокие концентрации диоксиацетона, что упрощает процесс выделения конечного продукта, снижает трудоемкость процесса.

.

15-20 95-98

98 . 48-63

10

Шта№{ бактерий Gluconobacter oxydans D-20 (коллекция Цеитрального музея промьшшениьос микроорганизмов Всесоюзного научио-исследоватепьского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЩШМ В-2520) - продуцент глице- ролдегидрогеназы окисляющий глицерин ;в диоксиацетон.