Штамм бактерий GLUсоNовастеR oxYDaNS - продуцент сорбозы Советский патент 1990 года по МПК C12P19/02 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и может найти применение в производстве витаминов, а именно аскорбиновой кислоты, при ее производстве были выделены из ферментеров два.близкородственных фага Gs-1 и , отличающихся по ультраструктуре и молеку- лярно-биологическим характеристикам как от фага А-1, так и от фагов, выделенных в природе, фаги Gs-1 и Gs-2 вызывают лизис производственного штамма Gluconobacter oxydans 15, что порождает срывы производства сорбозы и приводит к уменьшению выхода аскорбиновой кислоты и повышению ее себестоимости, Целью изобретения является получение штамма Gluconobacter oxydans, устойчивого к производственным фагам Gs-1 и Gs-2 и характеризующегося высокой эффективностью окисления сорбита в сорбозуо

Штамм G.oxydans ВНИИгенетика 16-С 12 получен из производственного штамма Gluconobacter oxydans 15 методом многоступенчатой селекции на устойчивость к фагу Gs-1, а затем - на устойчивость к фагу Gs-2o На каждой стадии селек ции проводилась оценка окислительной активности полученных клонов с помощью поляриметрического измерения образовавшейся сорбозы по методике, рекомендо- ванной промышленным регламентом на

Oi

сл ся

00 Од

со

3155

производство аскорбиновой кислоты Белгородского витаминного комбината. Штамм G.oxydans ВНИИгенетика 16-С12 хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-4160. Штамм депонирован также в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков и имеет регист рационный номер 1898.

Штамм G.oxydans ВНИИгенетика i 16-С12 имеет следующие признаки.

Культурально-морфологические свойства. Грамотрицательные неспорообра- зующие неподвижные клетки овальной формы, размером 0,8x1,0-1,2 мкм.

На агаризованной дрожжевой среде, содержащей (на 1 л): сорбит 100 г; дрожжевой автолизат (11% сухих ве- ществ) 60 мл; азотнокислый аммоний 1 rj агар 25 г (рН 5,8), после двух суток роста при 33°С штамм образует мелкие бесцветные блестящие куполообразные колонии правильной формы с ровным краем, имеющие гиалиновую струтуру и вязкую консистенцию.

На агаризованной среде с мелом, содержащей (на 1 л): глюкозу 50 г; дрожжевой экстракт 10 г; углекислый кальций 30 г} агар 25 г (рН 5,8), штамм после трех суток роста при 33°С образует колонии той же морфологии, вокруг которых наблюдается зона просветления агара.

На агаре Хоттингера штамм не растет. .

На мясо-пептонном агаре штамм не растет.

Физиолого-биохимические свойства; .Отношение к кислороду. Облигат- ный аэроб.

Отношение к источникам углерода. Усваивает сорбит, маннит, глюкозу, глицерин„ Не окисляет пируват, ацетат сукинато Желатину не разжижают.

Отношение к источникам азота. Использует соли аммония.

Нитрат не восстанавливает.

Отношение к температуре. Растет при 28-36°С. Оптимальная температура 34°С.

Отношение к рН среды. Растет при рН 3,5-6,0. Оптимальное значение рН 5,3.

Отношение к антибиотикам. Устой чив к хлорамфениколу (50 мг/л), эри; ромицину (20 мг/л), тетрациклину (30 мг/л), полимиксину (300 мг/л).

Q

5

0 5 п

0

0

5

Штамм хранится в лиофильно высушенном виде в запаянных стеклянных ампулах.

Чувствительность к фагам. Чувствительность предлагаемого штамма G.oxydans ВНИИгенетика 16-С12 и известного штамма G.oxydans 15 и производственным фагам и Gs-2 сравнивается путем титрования фагов на культурах обоих штаммов двуслойным методом. При высеве этих фагов на газон культуры известного штамма происходит лизис бактерий, проявляющийся в образовании негативных колоний фага. При высеве тех же фагов на газон предлагаемого штамма 16-С12 негативных колоний фага не образуется. Так, не было обнаружено ни одной негативной колонии фага Gs-1 при высеве на культуру штамма 16-С12 суспензии фага Gs-1, содержащей 5x10э фаговых частиц (по данным титрования фага на культуре известного штамма) . При высеве на культуру штамма 16-С12 фага Gs-2 в количестве 4x109 фаговых частиц (по данным титрования фага на культуре известного штамма) негативных колоний также не обнаруживается„

Устойчивость предлагаемого штамма 16-С12 к фагам Gs-1 и Gs-2 проявляется и при внесении фагов в жидкую культуру бактерийо Так, при введении в культуру известного штамма фага Gs-1 в количестве 1x10 фаговых частиц в 1 мл происходит лизис бактерий, проявляющийся в снижении оптической плотности культуры от 0,5 до 0,02 уже за первые 2 ч инкубации, тогда как оптическая плотность аналогичной культуры штамма 16-С12 в такой ситуации не менее 24 ч остается на уровне контроля.

Сравнение способности клеток обоих штаммов к адсорбции фагов Gs-1 и Gs-2 путем измерения титра фага в суспензии после осаждения бактерий центрифугированием показывает, что предлагаемый штамм 16-С12 сохранил такую же способность к адсорбции обоих фагов, что и известный штамм, Таким образом, устойчивость штамма 16-С12 к фагам Gs-1 и Gs-2 не связана с измененной адсорбцией фаговых частиц.

Продуктивность штамма.

Штамм G.oxydans ВНИИгенетика 16-С12 (ВКПМ В-4160) при культивировании в производственных условиях - в дрожжеаммонийной среде с 20% сорбитом позволяет достичь за 30-36 ч ферментации глубины окисления сорбита в сорбозу свыше 94%.

П р и м е РО Использование штамма G.oxydans ВНИИгенетика 16-С12 (ВКПМ- В-4160) для получения кристаллической сорбозы.

Исходную культуру штамма ВНИИгенетика 16-С12 выращивают в течение 2 сут при 33РС на косяках с агаризо- ванной средой следующего состава , (рН 5,6): сорбит 100 г, дрожжевой автолизат (11% сухих веществ) 60 мл, азотнокислый аммоний 1г; вода водопроводная (артезианская) 1 л.

Культуру бактерий с косяков засевают в пробирки, содержащие по 10 мл жидкой среды вышеуказанного состава, и растят 2 сут при . Для размножения полученной культуры ее 3 раза последовательно пересевают, разводя после 2 сут роста при 33 С 20-кратным объемом свежеприготовленной среды. Полученный посевной материал контролируют на отсутствие посторонней микрофлоры При полной стерильности культуры ее используют для промышленной ферментации.

Получение сорбозы в промышленных условиях ведут в ферментере объемом 5000 л, содержащем 2500 л среды, .

10

Для выделения сорбозы из окислен ного раствора его упаривают под вак умом при температуре не более 60°С затем охлаждают до 18-20рС и ведут кристаллизацию сорбозы при перемеши вании. Выпавшие кристаллы сорбозы с шат горячим (50°С) воздухом, просеи вают и собирают в соответствующую тару.

Продукт, получаемый с использова нием предлагаемого штамма ВНИИгенет ка 16-С12, соответствует требования промышленного регламента на произво

,, ствв L-сорбозы - промежуточного про дукта в синтезе аскорбиновой кислот

Основное отличие и преимущество предлагаемого штамма G.oxydans ВНИИ генетика 16-С12 (ВКПМ В-4160) по ср

20 нению с известным штаммом G.oxydans 15 заключается в устойчивости к про изводственным фагам Gs-I и Gs-2, чт позволяет вести процесс культивиров ния в производственных условиях без

25 фаголизиса. Тем самым сокращаются затраты на производство аскорбино- вой кислоты и увеличивается съем го тового продукта с 1 м3 питательной среды. Надсорбционный механизм ус30 тойчивости штамма ВНИИгенетика 16-С к фагам Gs-1 и позволяет испол зовать его в качестве сорбента для очистки производственных ферментеро и коммуникационных линий от этих фа

включающей 20% сорбита, 0,01% дрожже- ,,- гов. Кроме того, фагоустойчивость д

вого автолизата и 0,01% азотнокислого аммония (рН 5,3). Окисление ведут при интенсивной аэрации, подавая в ферментер не менее 3 л стерильного воздуха на 1 л среды/мин. Температура среды в ферментере 30-36°С, рН 4,0-4,5. Через 36 ч глубина окисления сорбита в сорбозу достигает 94%.

40

штамма ВНИИгенетика 16-С12 (ВКПМ В-4160) позволяет рекомендовать его для использования в непрерывном спо собе ферментациио

Формула изобретени Штамм бактерий Gluconobacter оху dans ВКПМ В-4160 - продуцент сорбоз

Для выделения сорбозы из окислен-., ного раствора его упаривают под вакуумом при температуре не более 60°С, затем охлаждают до 18-20рС и ведут кристаллизацию сорбозы при перемешивании. Выпавшие кристаллы сорбозы сушат горячим (50°С) воздухом, просеивают и собирают в соответствующую тару.

Продукт, получаемый с использованием предлагаемого штамма ВНИИгенетика 16-С12, соответствует требованиям промышленного регламента на производ, ствв L-сорбозы - промежуточного продукта в синтезе аскорбиновой кислоты.

Основное отличие и преимущество предлагаемого штамма G.oxydans ВНИИ- генетика 16-С12 (ВКПМ В-4160) по срав0 нению с известным штаммом G.oxydans 15 заключается в устойчивости к производственным фагам Gs-I и Gs-2, что позволяет вести процесс культивирования в производственных условиях без

5 фаголизиса. Тем самым сокращаются затраты на производство аскорбино- вой кислоты и увеличивается съем готового продукта с 1 м3 питательной среды. Надсорбционный механизм ус0 тойчивости штамма ВНИИгенетика 16-С12 к фагам Gs-1 и позволяет использовать его в качестве сорбента для очистки производственных ферментеров и коммуникационных линий от этих фа,,- гов. Кроме того, фагоустойчивость д

40

штамма ВНИИгенетика 16-С12 (ВКПМ В-4160) позволяет рекомендовать его для использования в непрерывном способе ферментациио

Формула изобретения Штамм бактерий Gluconobacter dans ВКПМ В-4160 - продуцент сорбозы.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма GLUCONOBACTER OXYDANS ВНИИгенетика 16-С12 (ВКПМ В-4160). Штамм получен методом многоступенчатой селекции на устойчивость к производственным фагам GS -1 и GS -2 из производственного штамма GLUCONOBACTER OXYDANS 15. При культивировании в производственных условиях на дрожжеаммонийной среде с 20%-ным сорбитом штамм позволяет за 30 - 36 ч ферментации достичь глубины окисления сорбита в сорбозу свыше 94%. Штамм характеризуется устойчивостью к фагам GS -1 и GS -2, лизирующим клетки производственных штаммов GLUCONOBACTER OXYDANS.