Способ определения активности щелочной фосфатазы Советский патент 1980 года по МПК G01N21/78 G01N33/50 

1

Изобретение относится к аналитической химии,а именно,к способам определения активности щелочной фосфатазы.

Известен способ определения активности щелочной фосфатазы путем обработки анализируемой пробы раствором п-нитрофенилфосфата в присутствии 1,5-4,5 М раствора солянокислого диэтаноламина с последующим спектрофотометрированием полученного раствора .

Недостатком способа является сложность определения.

Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения активности щелочной фосфатазы, заключающийся в обработке анализируемой пробы субстратом, состоящим из глицинового буфера, содержащего хлористый магний и раствора п-нитрофенилфосфата с последующим нагреванием полученного раствора при 37-39°С в течение 30 мин и охлаждением на ледяной бане, добавлением к охлажденному раствору NaOH и спектрофотометрировании полученного окрашенного раствора 2j.

Недостатками способа являются егс сложность и нестабильность окраски

конечного фотометрируемого продукта.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение стабильности окраски раствора.

Поставленная цель достигается описываемым способом определения активности щелочной фосфатазы, заключающимся в обработке анализируемой пробы cji- нафтилфосфатом (субстратом)и 4-бензоиламино-2,5-диметоксианилином с последующим спектрофотометрированием полученного окрашенного раствора.

ts

Отличительньлм признаком способа является использование в качестве субстратаoi-нафтилфосфата и обработка полученного раствора 4-бензоил20 амино-2,5-диметоксианилином.

Способ иллюстрируется следующим примером.

60 МП ot-нафтилфосфата растворяют в 10 мл дистиллированной воды,

25 нейтрёшизуют до ,05% раствором бикарбоната натрия и доводят объем раствора дв 20 мл. К 0,7 мл приготовленного раствора оО -нафтилфосфата приливают 0,7 МП ОЗМ Kap6oHaTHO-j5H

30 карбонатного буфера ,0 и 0,2 лл

супернатанта, полученного после центрифугирования гомогена при 7000 об/ми в течение 10 мин. После 30-минутной инкубации при приливают 0,2 мл 2% раствора соли 4-бенэоиламино 2,5-диметоксианилина и оставляют на 3 мин. За это время происходит связывание образовавшегося в результате ферментативной реакции 5 -нафтила с 4-6ензоиламино-2,5-диметоксианилином Останавливают ферментативную реакцию добавлением 0,2 мл 20% раствора NaOH. Затем приливают 1 мп дистиллированной воды и 2 мл ацетона для растворения образовавшегося комплекса oi-нафтола с красителем. Окрашенный раствор фотометрируют при длине волны 530 нм на спектрофотометре.

Активность фермента находят по величине экстинции при помощи калибровочного графика, который строят следующим образом.

В пробирку помещают 2-20 «i -нафтола, 0,7 мл ОЗМ карбонатно-бикарбонатного буфера ,0, доводят

объем до 1,6 мл дистиллированной водой, приливают 0,2 мл 0,2% раствора соли 4-бензоиламинр-2,5-диметоксианилина, через 3 мин приливают 0,2 мл 20% раствора NaOH, затем 1 мл воды и 2 мл ацетона. Фотометрируют при 530 нм на спектрофотометре. Активность фермента щелочной фосфатаэы выражают в единицах Е/ч, озиачающих число микромолей ot -нафтола, освобожденного 1 г ткани в течение 1 мин в данных условиях. Рассчитывают активность щелочной фосфатазы по формуле

5 где А - активность фермента, выраженная, в единицах Е/ч; С - концентрация ly - нафтола, освобожденного в результате реакции, выраженная в

0 микромолях.

В таблице приведены сравнительные данные определения щелочной фосфата- зы изсестнЕлм и предлагаемым способом