Способ определения субстрата или фер-МЕНТАТиВНОй АКТиВНОСТи B биОлОгичЕСКОММАТЕРиАлЕ Советский патент 1981 года по МПК C12Q1/26 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТА ИЛИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ ЧТО 0,00573 или 0,000573% аскорбата практически полностью тормозят тест до 41,5% кюветы 4 и 5-пок зывают полное устранение нарушения этих концентраций аскорбата добавкой по 0,0003% аскорбатоксидазы. П р и м е р 2. Обнаружение глюко с 2,2,-азино-ди(3-этил-бензтиазолин сульфонатомСб) ) iftSTS), РОТЭ и got) в фотометре, с длиной волны 432 им, с температурой измерения 25°С (см. табл. 2) . Кювета i соответствует ненарушен ному измерению (нет аскорбата) .Кюве ты 2 и 3 показывают, что 0,000573% или 0,0000573. мол.% аскорбата полностью тормозят тест до 2,1%. Кюветы 4 и 5 показывают полное устранение нарушения этих концентра ций аскорбата добавкой по 0,0003% аскорбатоксидазы. Примерз. Обнаружение мочевой кислоты посредством фенола, ами ноантипирина, POD и урикаэы на аналитическом автомате (Auto Analyzar) Принцип тестам мочевая кислота + -J- Оа + HaQ Р аллантоин + + HjOj - 2 H2.Og + 2,4-дихлорфенал + 4-аминоантипирин хинодный кр ситель + 2 HgO . Изготовление растворов. Реактив аскорба оксидаэы. В 600 бидистилдированной воды растворяетс содержимое флакона 1. Добавка 0,3 м Brij-35. Затем смесь вытверживается в темном флаконе приблизительно при четыре недели,при одну неделю. Реактив уриказы. В 800 мл бидистиллированной воды растворяется содержимое флакона 2. Добавка 2,0 мл В г Ij-35 . Затем смесь выдерживается в темном флаконе приблизительно при 4с четыре недели, приблизительно при 25°С одну неделю. Концентрация растворов. 0,63% фосфатного буферного раствора, рН 5,6 . 0,35% трис/ликюнной кислоты, рН 8,9, уриказы 0,001%, POD 0,000015%, 0,05% 2,4-дихлорфенола, 0,08% 4-аминоантипирина. П р и м е р 4. Обнаружение глюкозы с HK/Q 6Р-ОА, NADP, INT и диафоразой в фортометре. Измеряемая длина волны 492 нм, температура инкубации 25С (см. табл. 3). Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению. Кювета 2 показывает, что 0,0000573% аскорбата может тормозить тест на 34% кювета 3 показывает, что 0,0003% аскорбатоксидазы полностью устраняет это нарушение . П р и м е р 5. Определение глутамата посредством диафоразы в фотометре. Измеряемая длина волны 492 нм, температура 25°С(см. табл. 4}, Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению. кюветы 2 и 3 показывают, что 0,0029% или 0,00029% аскорбата тормозят тест на 700% или на 100%. Кюветы 4 и 5 показывают полное устранение этого нарушения добавкой 0,00006% аскорбатоксидазы. Примере. Определение тирозина с 3-метил-б калийсульфонил-бензтиазолон-гидра-зоном-(2) (SMBTH) и тирозиназой в фотометре, измеряемая длина волны 492 нм, измеряемая температура 25Ос(см. табл. 5. Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, в кювете 2 0,0057% аскорбата снижает теоретическую величану на 35%, в кювете 3 это нарушение полностью устраняется добавкой 0,003% аскорбатоксидазы. П р и м.е р 7. Определение пирокатехина с SMBTH и дифенол-оксидаЗОЙ (см. табл. 6) . Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению. В кювете 20,01145% аскорбата снижают теоретическую величину на 47% это нарушение полностью устраняется в кювете 3 добавкой 0,0003% аскорбатоксидаэы. Полученный способ позволяет полностью устранить вызванные ошибки наличием аскорбиновой кислоты при проведении окислительно-восстановительных реакций. Таблица 1

Фосфатный буферный раствор, рН 7,01, 1,368%

о-Дианизидин/, 0,5% POD, 0,18%

Раствор глюкозы, 0,172%

Раствор аскорбиновой кислоты

Вода

Аскорбатоксидаза 500 ед./мл, 0,05%

Инкубация 1 мин при , считывание Е , затем начинается реакция с

GOD 0,0333% Инкубация 30 мин при &Е Инкубация 30 мин при считывание Е,, дЕ0,505 0,000

Продолжение табл. 1

0,03 0,03 0,030,030,03

0,1 0,010,10,01

0,12 0,02 0,11 -0,09

-0,02. 0,02

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 ,считывание Е,вычисление из & 0,541 0,010 0,316 0,540 0,543 вычисление из АЕ 0,400,502 0,504

Фосфатный буферный раствор, рН 7,5, 1,36%

NADP INT по 0,1% Диафораза 5 Е/мп, 0,1% Раствор глюкозы, 0,005% Раствор аскорбата 0,17%

Аскорбатоксидаза, 0,00035%

Вода

Инкубация 3 мин при 25с, считывание Е на 1ало реакции с HK/G6P-DH-pacTBop по 0,14%0,050,05 0,05

Инкубация 15 мин, считывание Е, вычисление из Ej-E ДЕ ДЕ0,2340,307 0,230

Т а ti ) и

0,03

0,04

0,03

Таблица 4 Считывание IT- раствор 0,2 Инкубация 15 мин при 25с, считывание

ЛЕ

Компоненты

Фосфатный буферный, раствор рН 5,2, 3,4%

SMBTH 0,1 мол, 3%

Раствор аскорбиновой кислоты. О,112%

Вода

Аскорбатоксидаза 500 ,05%

Тирозиназа, 0,2 Инкубация 1 мин при 0,036% тирозин Инкубация 1 час при ДЕ

Продолжение табл. 4

0,184 1,560 0,380 0,186 0,182

iT а б л и ц а 5

Юовета

2,77

2,77 0,05 0,05

0/1

0,1 0,02

у

0,02 0,05

0,05 Е , начало реакции с 0,05 0,05 0,05 0,05 E/j вычисление из АЕ считываниеЕ , начало реакции с 0,050,05 0,05 считываниеЕ, вычисление из Е2-Е ЛЕ 1,1130,728 1,100

Компоненты Инкубация 1 мин при , считывание дефенолоксидаза, 0,2% 0,05 Инкубация 17 мин при 25-с считывание ЛЕ0,890 формула изобретения 1.Способ определения субстрата или ферментативной активности в био логическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции, отличающийся тем,что, с целью повьацения точности способа, в реакционную смесь вносят аскбрбатоксйдазу в количестве 100 Eff/мп исходной смеси, а учет ре акции ведут по образованию окрашенного продукта. 2.Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидазу вводят одновременно с Н О образукхцим ферментом.

Продолжение табл..

Кювета Е , начало реакции с 0,05 0,05 Е вычисление из Е„-Е. ДЕ 0,485 Г,896 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидазу вводят одновременно с солью тетразолия. 4. Способ по П.1, отлича ющ и и с я т-эм, что для получения окрашенного продукта аскорбатокси дазу вводят одновременно с фенолом. 5, Способ по П.1, отличающийся тем, что используют аскорбатоксидазу из Zucchini (Cucurbuta реро medunos,a). Источники информации, йринятые во внимание при экспертизе 1. Biochemical Copper Proceedings. «tarriman, N.V. 1965, с. 305-337.