Способ определения глутаматоксалацетаттрансаминазы или глутаматпируваттрансаминазы Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 

сн

Изобретение относится к способам определения активности фермента глутаматоксалацетаттрансаминазы (GOT) и глутаматпиру1ваттрансаминазы (GPT) , а также к реагентам, пригодным для проведения этого способа и может быть применено для определения названных ферментов в биологических жидкостях, таких как сыворотка, моча или в др.

Цель изобретения - ускорение анализа.

Определение глутаматоксалацетаттрансаминазы или глутаматп1фуваттрансаминазы осуществляют путем инкубации исследуемого фермента с глутаматом-в буферном растворе с последуюпщм фотометрированйем, для чего 50 ммоль/л глутамата предварительно вводят во взаимодействие с 0,150 ммоль/л окСаната или пирувата соответственно в буферном растворе с рН 7,0-9,0, далее в реакционную смесь вносят 10-300 ммоль/л Jf -аминобутирата с 500-2000 Ед/л аминобутираттрансаминазы, затем добавляют семиальдегиддегидрагеназу. Полученный восстановленньш NADP фотометрируют.

Способ осуществляют следующим образом.

Комбинируют реакции по уравнениям

ПАВ-GT

об -КС -аминобутират

сук-

цинатсемиальдегид +od-глутамат, где GAB-GT-j -аминобутираттрансаминаза; ,сукцинатсемиальдегид + NADP---Sqq д )iji

-S- сукцинат + NADPH + Н , где

SS -AB-DH сукцинатсемиальдегиддегидрогеназа,

и осуществляют реакцию, которую проводят с солью тетразола в присутствии переносчика электронов для повторного окисления NADPH при одновременном образовании окрашенного формазана, который легко можно измерить в видимой части спектра. Это соответствует уравнению:

NADPIl 4- МТТ + К ДиаФораз|

+ NADP/ где МТТ 3-(4,5-диметилтиазолйл-2)-2,5-дифенилтетразолила бромид.

Способ проводят при рН 7-9,5. При более высоких и более низких значениях рН происходит существенно замедление реакции с соответствующим удлинением времени, необходимого для проведения одного теста. Самые хорошие результаты получают при значениях рН в интервале 8-8,6.

Пригодная концентрация буфера лежит в интервале 5-0,5 моль/л, что соответствует концентрации буферной соли в тесте 0,05-6%. Предпочтительно использование буфера концентрацией 10-100 ммоль/л.

В качестве соли тетразола используют МТТ.

Хорошие результаты получены с хлоридом нитроголубого тетразола (NBT) и хлоридом 2-(п-йодофенил)-3-(п-нитрофенил)-5-фенилтетразола (INV). При измерении красителя формазана целесообразно добавлять поверхностноактивные вещества, которые улучшают растворимость красителя.

В примерах используют сокращения: GPT - глутаматпируваттрансаминаза;

GAB-GT - - аминобутираттрансаминаза:

SS-A1-DH - сук1щнатсемиальдегиддегидрогеназа;

GOT - глутаматоксалацетаттрансаминаза,

NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат;

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный;

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолила бромид;

Трис - трис(оксиметил)-аминометан; Тритон RX100 - алкиларилполиэтиленгликолевый эфир.

Пример 1. Определение GPT. Образование NADPH является сигналом измерения. Температура 25°С, длина волны 365 нм, тестовый объем 3 мл, 1-сантиметровая кювета.

Данные приведены в табл.1.

Исходный раствор перемешивают. Начинают реакцию с 0,5 мл сыворотки (GPT-обогащенная), перемешивают, 2 мин инкубируют, снимают показания

через 1,2,3 и 4 мин точного вре

мени, далее снимают .показания Е

и Е,

9

На основании полученных данных рассчитывают значение Е/мин.

Активность GPT в пробе рассчитывают по формуле

|ТГ Е. 1,714.

Ед/мл

Пример 2. Определение GPT. Образование формазана выбирают в качестве сигнала измерения. Температура 25°С, длина волны 578 нм, тестовый объем 3 мл, кювета толщиной 1 см. Б кювету пипеткой вводят вещества, указанные в табл.2. Исходньш раствор перемешивают. Начинают реакцию с 0,1 мл сыворотки (GPT-обогащенная), перемешивают, 2 мин инкубируют, снимают показачерез 1, 2, 3 и 4 мин точно го времени. Далее снимают показания Е, Е, Е и Е, на основании которых рассчитьгоают значение СРТ-Е/мин Активность в пробе рассчитывают по следующей формуле: ЛЕ 1,796 Ед/мл Пример 3. Определение GPT Образование NADPH принято в качеств сигнгша измерения. Температура изме рения 25 С, длина волны измерения 365 нм, тестовый объем мл, кювета толщиной 1 см. В кювету пипеткой вводят вещества, представленные в табл.3. Исходный раствор перемешивают. Реакцию начинают с 0,5 мл сыворотки (GOT-обогащенная), перемешивают, 2 мин инкубируют, снимают показание Е,, через 1, 2, 3 и 4 мин точно го времени, далее снимают показания Ej, Е 3 4 5 основании полученных данных рассчитывают ЛЕ/мин Активность GOT в пробе рассчитывают по формуле Ед/мл ЛЕ 1 ,717 Пример 4. Определение GOT Образование формазана принято в качестве сигнала измерения. Температура 25 С, длина волныизмерения 578 нм, тестовый объем 3 мл, кювё,та толщиной 1 см. Исходный раствор перемешивают. Реакцию начинают с 0,05 мл сыворот (GOT-обогащенная), перемешивают, 2 мин инкубируют, снинают показани EJ, через 1, 2, 3 и 4 мин точного времени, далее снимают показания Ей .и ЕС Z V 694 АКТИВНОСТЬ GOT в пробе рассчитывают по формуле ЕД/МЛ 3,593. П р е р 5. Определение на тестовой полосе. Пригодную бумагу пропитывают раствором, содержащим все реагенты, приведенные в примере 2, осторожно сушат, укрепляют на ПГ ИГОДРЮМ носителе, запечатывают и разрезают на полосы. После погружения в сьшоротку появляется красно-голубое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна активности ОРТ в пробе. Оценку можно проводить сравнением с пригодной шкалой стандартного окрашивания, а также с помощью отражательного фотометра. Пример 6. Определение GOT на тестовой полосе. Пригодную бумагу пропитывают раствором реагентов, приготовленным по примеру 4, осторожно высушивают, укрепляют на пригодном носителе, при необходимости запечатывают и разрезают на полосы. После . погрзгжения в сыворотку появляется kpacHo-голубое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна GOT-активности в пробе, Оценку можно проводить сравнением с пригодной шкалой стандартной окраски, а также с помощью отражательного фотометра. Формула изобретения Способ определения глутаматоксалацетаттрансаминазы шти глутаматпируваттрансаминазы путем инкубации исследуемого фермента с глутаматом в буферном растворе с последующим фотометрированием, отличающийся тем, что, с целью ускорения анализа, 50 ммоль/л глутамата предварительно вводят во взаимо-:- действие с 0,1-50 ммоль/л оксаната Или пирувата соответственно в буферном растворе с рН 7,0-9,0, далее в реакционную смесь вносят .10300 ммоль/Я J-аминобутирата и 5002000 Ед/л аминобутираттрансамнназы, затем добавляют семиальдегиддегидрагеназу; полученный восстановленный NADP фотометрируют.

Трис, НС1, рН 8;

3,50 м)оль/л

(0,6055%)

NADP, 27 ммоль/л

(2%)

-Аминобутират, ,9 ммоль/л, рН 8,3 (9%)0,2

Глутамат, 0,6, моль/л

рН 8,3 (9,8%)

Пируват натрия,

0,55 моль/л (6%)

GAB-GT, 86 ЕД/мл (11% протеина)

,02

25 (0,30275) 0,9 (0,067)

60 (0,06) 0,1 (1,47) 5,4 (0,06)

I,43 ЕД/МЛ (1,183)

Изобретение относится к клинической биохимии и предназначено для определения глутаматоксалацетаттрансаминазы и глутаматпируваттрансаминазы и реагента для их определения. Цель изобретения - ускорение способа. К глутамату добавляют пируват и )-аминобутират. При этом буферный раствор имеет рН 7,0-9,0. В реакционную смесь вносят аминобутираттрансаминазу и семиальдегид - дегидрогеназу. Производят фотометриро вание. Затем рассчитывают активность глутаматпируваттрансаминазы. 4 табл,.

Трис, НС1, рН 8,3; 50 ммоль/л (О,6055%)i содержащий 2% тритона RX100

NADP, 27 ммоль/л (2%)

J-Аминобутират, 0,9 моль/л (9%)

Глутамат, 0,6 моль/л (8,8%)

Пируват натрия, 0,55 моль/л (6%)

Таблица 2

Тритон КХГОО

(1%)

Трис, 25 (0,30275)

0,9 (0,067)

0,2 60 (0,06)

0,5 0,1 (1,47)

0,03 5,4 (0,06)

12762698

jZIZiIZZI

0,2 0,1 (0,00414)

1 ,4:3 Ед/мл

0,04 (0,183%)

2,2 Ед/л

0,05 (0,183%)

0,077 Ед/мл 0,01 (0,0017%)

0,26

«. .......«..«|...«.

Количест- Концентрация

Имидазол, HC1 рН 7,6

100 ммоль/л

(6,808%)

NADP, 27 ммоль/л (2%)

у-Аминобутират,

0,9 моль/л рН 8,3 (9%)

Глужамат, 0,6 ммоль/л

рН 8,3 (8,8%)

Оксалацетат,

20,8 ммоль/л (0,275%)

GAB-GT, 86 Ед/л

(11% протеина)

SS-AI-DH, 133 Ед/мл

(11% протеина)

HjO0,1

Продолжение табл.2.

I X

Таблица 3

во, мм в тесте,

ммоль/л (%)

50 (3,404) 0,9 (0,067)

90 (0,9) 60 (0,88)

0,65 (0,00917)

1,43 Ед/мл (0,183%)

2,22 Ед/мл (0,183%)