Способ определения содержания креатинина, креатина и саркозина в биологической жидкости Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 G01N33/70 

Изобретение относится к биохимии и может найти пр именение в клинической диагностике.

Цель - повышение чувствительности способа.

Пример 1. Культивирование Chainia purpurogena DSM-43156.

В колбе для встряхивания организм ( культивируют в сложной среде указанного состава:5 г дрожжевого экстракта; 3 г пептона (типично переваренный); 2 г NaCl; 0,24 г MgS04-«7HtO; 0,014 г СаС1а х7НгО; 2 г глюкозы; 10 г саркозина; 1 л воды; рН 7,0. Выращенная при 28°С культура через .30 ч показывает активность около 400 V/л. Пример 2. Выделение саркози- ноксидаэы Е.С.1„5.3.1 из Chainia purpurogena.

О4

2,9 кг влажной массы Chainia pur- purogena DSM-43156 (получена в результате обработки 95 л культуры) суспендируют в 15 л фосфатного буферного раствора с концентрацией 20 ммоль/л, рН 8,0, после чего суспензию в течение 4 ч выдерживают при 25° С с 4 г лизоцима. К обработанной суспензии Прибавляют такое количество 10% раст- вора полиэтиленимина (Polymin-G-20// //BASF), чтобы произошло полное отделение нуклеиновых кислот и посторонних белков„ Саркозиноксидаэу, которая Находится в надосадочной жидкости,, Связывают слабоосновным анионоообмен- ником (ДЕАЕ-Сефадекс), после чего элюируют с возрастающим солевым градиентом. Прибавлением сульфата аммония элюат доводят до концентрации 0,6 моль/л. Фермент присоединяют к фенил-сефароэе, после чего проводят Хроматографирование с возрастающим градиентом сульфата аммония (указанный фосфатный буферный раствор). Элю- ат, содержащий более 4 V/мг белка, прибавлением твердого сульфата аммония доводят до концентрации - 2,4 моль/л. Осадок обрабатывают 0,1 моль/л фосфатным буферным раствором, после чего саркозиноксидазу дополнительно очищают пропусканием через молекулярные сита (Sephacryl-S- -200, Pharmacia). Очищенный фермент имеет удельную активность 5,5 V/мг.

П р и м е р 3. Выращивание Chairiia ochraceae DSM-43155.

Организм культивируют во встряхиваемой колбе в комплексной среде следующего состава: 5,00 г/л дрожжевого экстракта; 3,00 г/л пептона (типично переваренный); 2,00 г/л Nad; 0,24 г/л MgS04 7Н,0; 0,014 г/л CaCl гх ЛЦО; 2,00 г/л глюкозы; 10,00 г/л саркозина; рН 7,0. Разводимая при 28° С культура через 30 ч дает активность саркозиноксидазы около 200 мочевины/л.

П р и м е р 4. Выделение саркозиноксидазы из Chainia ochraceae.

2,6 кг влажной массы Chainia ochra ceae (DSM-43155) из 81 л культуры (200 мочевины/л, разведенной по примеру 3) суспендируют с 14 л 20 ммоль/ фосфатного буфера, рН 8,0. и растворяют в течение 4 ч при 35 С с 3,8 г лизоцима. После этого, как описано в примере 2, проводят негативное осаждение полиэтиленимина и хроматографирование ДЕАЕ-Сефадекс. Элюат смешивают с сульфатом аммония до 3,0 моль/л, рН 8,0. Выпавшую саркозиноксидазу центрифугируют и перевесят в фосфатный буфер (20 ммоль/л, рН 8,0). Частично очищенный фермент имеет удельную активность 2,1 мочевины/л.

П р и м е р 5. Выращивание Strep- tomyces flocculus DSM-40327.

Организм культивируют во встряхиваемой колбе в комплексной среде следующего состава: 5,00 г/л дрожжевого экстракта; 3,00 г/л пептона (типично переваренный); 2,00 г/л NaCl; 0,24 г/ MgS04 7Н70; 0,014 г/л CaCl2 7Н20; 2,00 г/л глюкозы; 10,00 г/л саркозина; рН 7,0. Выращиваемая при 28СС культура через 30 ч делает активность саркозиноксидазы около 30 мочевины/л.

Пример 6. Выделение саркозиноксидазы из Streptomyces flocculus,

3,1 кг влажной массы Streptomyces flocculus (DSM-40327) из 98 л культуры (30 мочевины/л, по примеру 5) растворяют по аналогии с примером 4 и выделяют фермент через осаждение полиэтиленимином, хроматографию ДЕАЕ-Сефадекс и осаждение сульфатом аммония. Частично очищенный фермент имеет удельную активность около 0,35 мочевины/мг протеина.

Пример 7. Применение саркозиноксидазы для определения креатини- на. Реактив I. Реактив для определения контрольного значения пробы: Фосфат калия

(рН 7,9), ммоль/л, 150

(или 0,1 моль/л TES/KOH, рН 7,9)

4-Аминоантипирин, ммоль/л0,8

2,4,6-Трибром-

-3-оксибензойная кислота,

ммоль/л8,6

K4Fe(CN)

мкмоль/л10

Na-холат,

ммоль/л

Lutensol%N 50,

(вес/об.)%0,5

Креатинаминогидролаза, ед/мл 12

Саркозиноксидаза по примеру 2, ед/мл

6,5

Пероксидаза,-

ед/мл2

Липазч, ед/мп2

Аскорбатоксидаза,

ед/мп10

Реактив (II) (пробный реактив): реактив I плюс 25 ед/мл креатинамидо- гидролазы.

Осуществление теста (смесь для определения): длина волны 546 нм; Т 25°С (или 37°С); толщина слоя 1 см; измерение по отношению к воздуху (см. табл. 1).

Инкубирование проводят в течение 20 мин при 25 или 37°С, а затем измеряют экстинкции Е f - Е4

Е (Е4 - ЕЭ) - (Е7-Е,).

Расчет концентрации креатинина пробе: через совместно введенный ный стандартный образец 2 мг/дд Для этого стандартный образец приняют в такой же смеси для опредения, что и пробу.

Примерв. Применение сарк ноксидазы для определения саркози Реактив I (реактив для определе холостой пробы):

Фосфат калия

(рН 7,9),

ммоль/л150

(или 0,1 моль/л TES/KOH, рН 7,9)

4-Аминоантипирин, ммоль/л 0,8

2,4,6-Трибром-2-оксибензойная кислота,

ммоль/л8,6

K4Fe(CN)t,

ммоль/л10

Холат натрия,

мкмоль/Лр 5

Lutensol

ON 50,

(вес/об.)%0,5

Пероксидаза,

ед/мл2

Аскорбатоксидаза,ед/мл10

Липаза, ед/мл2

Реактив II (реактив для проб): реактив 1+6,5 ед/мл саркозинокси дазы.

Осуществление теста (смесь для ределения) : длина волны 546 нм; Т (или 37°С); толщина слоя

5

0

0

5

0

5

5

0

5

0

1 см; измерение по отношению к воздуху (см. табл. 2).

Инкубируют в течение 20 мин при 25 или 37°С, затем измеряют экстинкции Et-Et

Е ()-(E1-EO.

Расчет концентрации саркозина в пробе: через совместно введенный водный стандарт (2 мг/дл). Стандарт при этом должен вводиться в определяемую смесь как проба.

Л р и м е р 9. Применение саркози- ноксидазы для определения креатина.

Реактив I (реактив для определения холостой пробы):

Фосфат калия

(рН 7,9),ммоль/л 150

(или 0,1 моль/,л TES/KOH, рН 7,9)

4-Аминоантипирин, ммоль/л0,8

2,4,6-Трибром-3-оксибензойная кислота,

ммоль/л8,6

K4Fe(CN) ,

мкмоль/л-10

Холат натрия,

ммоль/л 5

Lutensol

ON 50,

(вес/об. )#,0,5

Саркозиноксидаза согласно

примеру 2,

ед/мл6,5

Пероксидаза,

ед/мл2

Липаза,

ед/мл2

Аскорбатоксидаза, ед/мл10

Реактив II (реактив для проб): реактив 1+12 ед/мл креатинамидогидро- лазы.

Осуществление теста (смесь для определения): длина волны 546 нм; Т 25°С (или 37°С); толщина слоя 1 см; измерение по отношению к воздуху (см. табл. 3).

Инкубируют в течение 20 мин при 25 или 37°С, затем измеряют экстинкции Е ,-Е 4

Е - (Е4-КЭ)-(Ё2-Е,).

Расчет концентрации креатина в пробе: через совместно введенный вод- j ный стандарт (2 мг/мл)

Стандарт при этом должен вводиться в определяемую смесь как проба.

Формула изобретения

Способ определения содержания кре- атинина, креатина и capКозина в биологической жидкости путем инкубации пробы с реагентом, содержащим буфер- 15 ное вещество, 4-аминоантипирин, пе- роксидазу и саркозиноксидазу с последующим измерением интенсивности окраски полученной смеси в сравнении со стандартным образцом, отличаю- 20 щ и и с я тем; что, с целью увеличения чувствительности способа, используют два реагента, инкубацию трех

15829938

проб проводят при соотношении (по объему) пробы: реагент 0,05-1, реагент I содержит буфер с рН 7,9, 4-ами- ноантипирин 0,8 ммоль/л, пероксидазу 2 ед/мл, в соответствующем случае саркозиноксидазу ,6,5 ед./мл и дополнительно халат натрия 5 ммоль/л, 2,4,6-три- бром-3-оксибензойную кислоту 10 8,6 ммоль/л, железо-синеродистый калий 10 мкмоль/л, Lutensol®ON 50 0,5% (мае./об.), липазу 2 ед./мл, ас- корбатоксидазу 10 ед./мл и в соответствующем случае креатинаминогидролазу 12 ед./мл, а реагент II содержит в соответствующем случае саркозиноксидазу 6,5 ед./мл и креатинаминогид-- ролазу 25 ед„/мл, измерение интенсивности окраски проводят при 546 нм, при этом используют саркозиноксидазу из Chainia purpurogena DSM-43156, Chainia ochraceae DSM-43155, Strepto- myces flocculus DSM-40327.

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в клинической диагностике. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Содержание креатина, креатинина и саркозина в биологической жидкости определяют путем инкубации 3-х проб с двумя реагентами при соотношении по объему проба: реагент 0,05 - 1, при этом реагент 1 содержит буфер с PH 7,9, 4-аминоантипирин 0,8 ммоль/л, пероксидазу 2 ед/мл, в соответствующем случае саркозиноксидаду - 6,5 ед/мл и дополнительно холат натрия 5 ммоль/л, 2,4,6-трибром-3-оксибензойную кислоту 8,6 ммоль/л, железо-синеродистый калий 10 мкмоль/л, LUTENSOL @ ON 50 0,5 мас/об.%, липазу 2 ед/мл, аскорбатоксидазу 10 ед/мл и в соответствующем случае креатинаминогидролазу 12 ед/мл, а реагент II содержит в соответствующем случае саркозиноксидазу 6,5 ед/мл и креатинами - ногидролазу 25 ед/мл с последующим измерением интенсивности окраски в полученной смеси при 546 нм в сравнении со стандартным образцом, при этом используют CHAINIA PURPUROGENA DSM - 43156, CHAINIA OCHARACEAE DSM - 43155, STREPTOMYCES FLOCCULUS DSM - 40327. Применение способа позволяет повысить более чем в три раза чувствительность способа определения креатина, креатинина и саркозина по сравнению с прототипом. 3 табл.

Реактив 11,00

Реактив II

Н200,05

Проба

Таблица 1

Таблица 2

1,00

1,00 0,05

1,00 0,05

I II

1,00 0,05

1582993

Таблица 3

10

1,00 0,05

1,00 0,05