Способ получения иммобилизован-НОй пОлиРибОНуКлЕОТидфОСфОРилАзы Советский патент 1981 года по МПК A61K38/45 

пой иолирибопуклеотидфосфорилазы достигается за счет сохранения естественной ие|)1юначал151ЮЙ актнпностн фермента.

Носитель - гид()оокнсь алюминия у-А1(ОН);-. характеризуется высокой адсо)би,ионной способностью за счет 1зозникновеиня водородных связей, а также больН1ОЙ площадью контактирующей иове)хностн, что снособствует новыщению скорости н эффективности адсорбции.

Стабильность н устойчивость связи носнтель-фермент иовышается в ироцессе иредварительной обработки носителя в водно растворе. Предварительная активация увеличивает а.дсорбционную способность гидроокиси алюминия за счет образования донолнительных водородных свяaeii.

Короткий срок иммобилизации (10 мин) иредотврашает инактивацию фермента. Темнература нроцесса 18-20°С также обеснечивает оптимальность сохранения активности в ироцесее иммобилизации иолирибоиуклеотидфосфорилазы. Соотиоишнне фс|)1ент : носитель создает е1)еду иммобнчизацци, обеснечивающую иолиое связывание (jiepMeiiTa -- 100%, что также предотвращает образование несвязанного белка и возникающие ири этом иоте1)и активности. Уд.лине1-1ие срока «иолужнзни фермента (с 25 до 40 суток) свидетельствует об устойчивости н стабильности иммобилизо ванной цолнрибонуклеотидфосфори.лазы и обеспечивается за счет высокой стенсни Ч1 стоты адеорбнрованного фе1змента и воз1)аста11ия степени связывания белка и носителя.

Пример 1. К 16 мл суспензин 1,01 г у-А. (ОН)з, нредварнтельно активнрованнон выдерживанием в течение 4 месяцев в водН.ОМ растворе нри О-8°С и обработанной 5 мл 0,5 М трис-НСЛ буфером, рН 8,1, ирибавляют 150 ед. (45 мг белка) полирибонуклеотидфосфорилазы на Е. соИ нри комнатной температуре и неремешивании в теченне 10 мин (время адсорбцин). Для онределения активности фермента инкубируют нри 37 С 1 м.т реакционной смеси, содержащей, мкммоль: АДФ 25; трис-НС буфер 100; Mg (СПзСОО), 10 (1)П 8,0) и фермент. 1 г -А (ОП)з связывают 45 мг

белка с активностью 150 e.i. Выход активности 100%.

Пример 2. К 48 мл суснеизни 13,3 г --А1 (ОН)з, предварительно активированио1 выдерживанием в течение 4 месяцев

в водном растворе нри О-8С и обработанной 25 мл 0,5 М трис-НС1 буфером, рН 8,1, нрибавляют 2070 ед. (621 мг белка) иолирибоиуклеотидфосфорилазы из Е. соИ нри комнатной температуре н неремещивании

в течение 10 мин (время адсорбции). Онределяют активность фермента. 1 г у-А (ОН)з связывают 45 мг белка с активностью 150 ед. Выход активности 100%. Определение активности ноли))ябонуклеотидфосфорилазы: Активность-результат но кривой X разведение X 2 (инкубация 30 мин X нересчет на 1 мл) 0,02xiOx Х2Х20-8 ед./мл (4 ед./мг белка).

Ф о р М у л а н 3 о б р е т е н и яС.нособ получения иммобилизо 5анноГ; нолирибонуклеотидфосфорилазынуте.х;

связывания ее с неорганическим водонерастворимым носителем в буфериой среде, отличающийся тем, что, с целью увеличения активности и иовьпиения срока «нолужизни иммобилизованной иолирибонуклеотидфосфорилазы, в качестве носителя иснользуют гидроокись ал оминня . у-форме, которую предварительно активируют выдерживанне в воде при О- -8С в течение 4 месяцев, а связывание фермента с носителем проводят нрн соотнощении соответственно 1 : (21,5-22.5) и нри темне ратуре 18-20°С.

Источники информации:, ирииятые во внимание нри )

1. Авторское свидетельство ССС Л 498315. кл. С 07 G 7/0-2. 1974 кюототип).