Способ получения иммобилизованной целлюлозы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/42 C12N11/00 

00

Изобретение относится к способу получения и дмобилизованных ферментов, в частности целлюлазы. Иммобилизованные ферменты используются в качестве биохимических реактивов, лекарственных препаратор, а также в химической, лсикробиологической и пищевой промышленности в качестве гетерогенных биокатализаторов.

Имглобилизация целлюлазы обеспечивает создание более эффективного гид-г ролизующего агента.

Известна стабилизация целлюлазы в растворимой форме l и иммобилизация целлюлазы на нерастворимых носителях 2 , з ,

Практическое использование таких ферментов, как целлюлаза и 6 -глгокозидаза, входящих в целлюлолитический комплекс, требует получения целлюлазы в нерастворимой форме.

Известен способ получения иммобилизованной целлюлазы путем связывания ее с пенополиуретаном. Однако в результате процесса происходит значительная инактивация фермента 2,

Известен также способ получения иммобилизованной целлюлазы из Азрегgillus niger путем связывания фермента с полимернь 1 носителем-полиакрилонитрилсмолой. Активность поО

mi

NH

liN в результате высокой реакционноспособности хинонов реакция ковалент ного связывания фермента с носителем проходит быстро и с небольшими потерями фермента. Продолжительность реа ции связывания 1 ч. Связывается до 72% от взятого количества фермента. Это обеспечивает экономию фермента. На данном носителе хорошо иммобилизуются все компоненты целлюлолитического комплекса. -1, 4-Эндоглюкан зы иммобилизуются с сохранением 80,9 от исходной активности (по На-КМЦ, P-I,4-глюканцеллобиогидрЬлазы иммобилизуются с сохранением 60% от исходной активности (по целлобиозе), Иммобилизованные П -глюк зидазы по казывают 37% активности от активности исходных р -глюкозидаз (по п-нитрофенил A,D-глюкoпиpaнoзидyJ . Пример 1. К 2,5 г носителя (с содержанием 280 мкг-экв, хиноновых групп на 1 (г носитех я) прибавляют pa хвор 1,0 г,целлюлазного препарата в

лученной иммобилизованной целлюлазы. составляет 20% от исходной активности фермента з .

Недостатком способа является низкая активность иммобилизованной целлюлазы.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности иммобилизованной целлюлазы.

Цель достигается способом получения иммобилизованной целлюлазы, заключающимся в ковалентном связывании целлюлазы с полимерным носителем, отличительныг т особенностями которого являются использование в качестве полимерного носителя хитина, активированного п-бензохиноном, и ведение процесса при весовом соотношении целлюлаза : носитель (0,06-, 0,4 : 1).

Хитин, активированный п-бензохиноном, содержит 0,2-0,28 мкг.экв хинновых групп на 1 г носителя.

Электронно-акцепторные карбонильн группы создают недостаток электронов на углеродном кольце, вследствие чего хиноны являются электроакцепторными соединениями и легко вступают в реакцию с нуклеофильными реагентами. Схема реакции следующая:

4- HZN-целлюлазацеллюлоза10 мл 0,1 н, шдетатного буфера (рН4,8). Используется целл олазный препарат из гриба Geotrichum candidum С содержанием белка 50% и эндоглюканазной (по йа-К1 1Ц активностью 11,37 мкмоль глюкозы/мг белка, целлобиазной (по целлобиозе) активностью 1,13 мкмоль глюкозы/мг белка и |5 -глюкозидазной (по п-нитрофенил-р-В-глюкопиранозиду) активностью 1,16 мшлолъ глюкозы/мг белка,. Выдерживают при комнатной температуре 1 ч и отфильтровывают. Промывают 3x15 мл 1 М раствора NaCI и 2 х 10 мл ацетатного буфера. Связывается 72% от взятого количества белка. Полученный препарат иммобилизованной целлюлазы содержит 43,6 мг белка на 1 г носителя. Активность иммобилизованной це 1люлазы: эндоглюканазная 9,2 мкмоль глюкозы/мг .белка (80,9%), целлобиазH.afi 0,8 мкМоль глюкозы/мг белкд (69,8% , -глюкозидазная 0/43 мкмол глюкозы/мг белка (36,9%) , Пример2. К1 г носителя пр бавляют раствор 0,2 г целлюлазного препарата из Geotrichum candidum в 3 мл 0,05 н. ацетатного буфера рН 4,8). Выдерживают при комнатной температуре 1 ч и отфильтровывают, Промывают 3 X 10 мл 1 М раствора NaCI и 2 X 5 мл ацетатного буфера. Получают препарат иммобилизованной целлюлазы с активностью: эндоглюкан ной 9,13 мк.моль глюкозы/мг белка (80,2%), целлобиазной 0,68 мкмоль глюкозы/мг- белка (60 , 0% , р-глюкози дазной 0,42 мкмоль глюкозы/мг белка (,37,1%) . Пример 3. К2г носителя прибавляют раствор 0,3 г целлюлазно препарата в 4 мл 0,05 н, ацетатного буфера (рН 4,8). Используется целлю лазный препарат из гриба Trichode rm lignoEum с содержанием белка 40% и эндоглюконазной активностью 32 мкмол глюкозы/мг белка, целлобиазной акти ностью 3,4 мкмоль глюкозы/мг белка, В - глюкозидазной активностью 1,9 -мкмоль . глюкозы/мг белка. Ёыдерживают при 4 С в течение 20 ч.Отфильтровывают и промывают Зх15мл1М11аС1и1х10мл ацетатного буфера. Получают препарат иммобилизованной целлюлазы с содержанием белка 43,2 мг на 1 г носител Активность иглмобилизоваиной целл лазы: эндоглюканазнал 25,8 мкмоль глюкозы/мг белка (80,8%) ; целлобиаз ная 2,0 глюкозы/мг белка (60,1%) , р -глюкозидазная 0,7мкмоль глюкозы/мг белка (37,0%) . Определение активностей целлюлазы 1. Глюканазная (по Ka-KMU. Активность определяется nd количе ству редуцирующих Сахаров, образующихся при гидролизе 1 мл 1%-ного ра твора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы ;(Ка-КМЦ) в течение 1 ч при 50°С в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4;8). Определение редуцирующих Сахаров проводят с 3,5-динитросалициловой кислотой. По калибровочной кривой глюкозы определяют активность в г глюкозы на 1 мл реакционной смеси и пересчитывают в мкмоль глюкозы на 1 мг связанного белка. 2.Целлобиазная fno целлобиозе). Активность определяется по количеству редуцирующих сахароз, образующихся при гидролизе 1 мл 0,2%-ного раствора целлобиозы в течение 0,5 ч при в 0,25 М ацетатном буфере (рН 4,7). Определение редуцирующих Сахаров проводят глюкозооксидазным методом. 3.Арил-/ -глюкозидазная /(по п-нитп рофенил-р-Т-глюкопиранозиду . Активность определяется по количеству п-нитрофенола, образовавшегося при гидролизе 1 мл 0,001 М п-нитрофенил-П) - D -глюкопиранозида в течение 10 мин при 40с в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,7). После колориметрирования (3 фильтр) по калибровочной кривой определяют содержание п-нитрофенола, пересчитывают в мкмоль на 1 мг белка. Преимуществами предлагаемого способа являются экономия ферментного препарата и увеличение удельной активности иммобилизованного фермента. Высокие показатели всех активностей иммобилизованной целлюлазы являются предпосылкой практического использования иммобилизованного препарата. Иммобилизованная целлобиаза может быть применена д.пя окончательного гидролиза oлигocaxapидoBf получаемых в процессе ферментативного расщепления цел;1юлозы ферментами, содержащими недостаточное количество целлобиазы, до глюкозы. Иммобилизованные (З-глюконазы могут найти применение для гидролиза -глюканов. Иммобилизованная Д-глюкозидаза может, быть использована для Получения из/5-глюкозидов агликонов, которые применяются в фармацевтической промышленности.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ путем :.овалентного связывания целлюлазы с пoJ:имepным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности получаемого продукта, в качестве полимерного носителя используют хитин, активированный п-бензохиноном, и процесс -ведут при весовом соотношении целлюлазы: носитель