Способ получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса Советский патент 1983 года по МПК C12N9/24 C12N11/14 

СП

сд 41

о

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментов, например гёмицеллголаэного комплекса.

Гемицеллюлазы используются при гидролизе гемйцеллюлозны:с компонен- тов растительной ткани,,Продукты гидролиза являются исходным сырьем для производства фурфурола, этилового спирта, кормовых дрожжей, кристаллической ксилозы, триоксиглутаровой кислоты, пятиатомного спирта ксилита, метилглиоксаля, эритроновой :и глицериновой кислоты, глицерина, гликоля, пропиленгликоля и целого ряда органических соединений. Иммобилизация гемицеллюлазы обеспечивает создание более эффективных гидролизующих ai eHTOB,

Известен способ иммобилизации ксилаказы совместно с В-ксилозидазой и ферментом, разрушающим урановые кислоты, на пористом стекле с помощью глутарового альдегида Y) .

Недостатком способа является низ кий выход иммобилизованной ксиланазы - 10%.

,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса путем ковалентного связывания ферментного препарата с нерастворимым носителем, в качестве которого,идпользугот сополимер ангидрида малеиновой. кислоты и бутандиолг. дивинилэфира в среде 6 ,05 М фосфатного буфера, рН 7, при соотношении носи- тель:фермент « 1:0,5. Связывается 50% от взятого количества белка, Ксиланазная активность полученногй, иммобилизованного препарата 58-59% от исходной активности 2J .

Недостатками способа являются большие потери фермента, так как ковалентное .связывание фермента с носителем осуществляется через ангидридные группы, которые крайне неустойчивы в водных растворах, а также низкий выход по активности (58-59% от исходной).

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и комплексное использование исходного сырья.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса, эаключаяицимс.я в ковалентном связываний ферментного препарата с нерастворимым носителем, с использованием ферментного препарата AspergifKus niger 15, содержащего ксилана эу, арабиназу, галактаназу и маннаназу, причем в качестве носителя используют бензохиноновый силохром при соотношении носитель:фермент 1:(0,02 - Of03) и процесс проводят в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,05,0.

Для иммобилизации используют технологический препарат Asp. nlger, содержащий 4 фермента с достаточно высокой активностью.

Иммобилизация предлагаемым способом обеспечивает сохранение всех 4 ферментных, активностей, крометого по отношению к арабиназной, галактаназной и манианазной активностям наблюдается повышение активности за счет очистки препарата в процессе иммобилизации.

Ксиланаза иммобилизуется с сохранением 89% активности от исходной (по 4-0-метилглюкуроноксилану), арабиназа - с сохранением 113% активности от исходной (по арабинану), галактаназа - с сохранением 114% активности от исходной (по галактану), маннаназа - с сохранением 142% активности от исходной (по галактоманнану) .

Силохром, активированный П -бензохиноном, является электронноакцепторным соединением и легко вступает в реакции с нуклеофильными реагентами. Схема реакции следующая;

О

Силохром П n-J-VHi-гемицеллюлаза- ,

силохром-NH f| -гемицеллюлаза

В результате высокой реакциониоспособности хинойОв реакция ковалеитного связывания фермента с носителем происходит быстро и с небольшими потерями фермента.

Продолжительность реакции связывания 2 ч. Связывается до 80% от взятого количества белка.

Hk данном носителе хорошо иммобилизуются все компоненты гемицеллюлазного комплекса. Условия иммобилизации и свойства носителя обеспечивают сохранение вьасоких активностей иммобилизованного препарата. Связывание большей, чем балластных белков, части белков-ферментов-обеспечивает Ъовышенную активность иммобилизованного гемицеллюлазного комплекса по сравнению с соответствующими активностями в исходном препарате.

Способ осуществляют следукяцим образом.

При контактировании раствора ферментного пр парата Asp. niger 15 с бемзохинонбвым силохромом при весовых соотношениях носитель:фермент. (0,02 - 0,03) в среде 0,1 М ацетатного буфера (рН 4-5) получают имобилизованный ферментный препарат | . с ксилаиазной активностью не менее 89% от исходной} арабиноэидаэной 113%, галактозИдаэной - 114%, маннозидазной - 142% от исходной активности. - . 5

В результата имеет Место более комплексное использование исходного сырья.

Пример 1. К0,5г бензохиноинового силохрома прибавляют раст- tO вор 0,05 г ферментного препарата гемицеллюлазы в 2. мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,6. Весовое соотношение носитель 5 белок 1«0,02. Используют геммицеллюлазный препарат из 15 AspergiBeus niger ISvc содержанием белка 20% и ксиланазной активностью 0,985 ед/мг белка, арабиназной 0,194 ед/мг белка, галактаназной0,081 ед/мг белка, Маннаназной - 20 0,026 ед/мг белка.

Внадерживают 2 ч при и отфильтровывают. Промывают мл 1 Н раствора NaC8 и 2 5 мл ацетатного, буфера.25

Полученный препарат иммобилизованной гемицеллюлазы содержит 1-6 мг белка на г носителя (80%.выход по белку).

Активность препарата: ксиланазная - 0,88.0 ед/мг белка (89,3% от исходной); арабиназная - 0,220 ед/мг белка (113,4% от исходиой); галактаназная - 0,093 ед/мг белка (114,8% от исходно) ,маннаназная - 0,037 ед/мг белка (142,3% от исходной). 35

Пример 2. К2г бензохиноинового силохрома прибавляют раствор 0,30 г ферментного препарата гемицеллюлазы из AspergiC6us niger 15 в 8 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0.40 Отношение носитель: белок 1:0,03.

Выдерживают 2 ч при 20с и отфильтровывают. Промывают 330 мл 1 М раствора NaC и 2 15 мл ацетатного -, буфера. Полученный препарат иммоби- 45 изованной гемицеллюлазы содержит 24 мг белка на г носителя ( выхода) .

Активность иммобилизованной ге- { ицеллюлазы: ксиланаз ная - 0,883 ед/Mv CQ белка (89,7% от исходной); арабиназная - 0,221 ед/мг белка (113,9% от сходной); галактаназная 0,092 ед/мг белка (114,9%от исходной); маннаназная - 0,037 -ед/мг белка (142,7% от исходной).

Примерз. К 1г бензохиноин ового силохрома прибавляют раствор ,125 г ферментного препарата гемицеллкшаза из Г AsperglCEus niger 15 4 МП 0,1 М ацетатного буфера рН 4 60 (отношение 1:0,025).

Выдерживают 2 ч при и отильтровывают. Промывают 3-15 мл 1 М, аствора NaCB и 2-10 мл ацетатного уфера.65

Полученный препарат иммобилизованной гемицеллюлаэы содержит 20 мг белка на г носителя (выход 80%).

. Активность иммобилизованной гемицеллюлазы: ксиланазная - 0,886 ед/мг белка (90% от исходной); арабиназная - 0,219 ед/мг белка (119% от исходной),галактаназная - 0,093 ед/мг белка (115%.от исходной); маннаиаэная - 0,038 ед/мг белка (146,1% от исходной.

Определение гемицеллюлазных активностей.

Ксилан.азная активность.

К 5 мг 4-0-метилг юкуропоксилана добавляют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска влажного иммобилизованного фермента 5 мг (содержание сухих веществ 30%). Инкубация 30 мин при 40с. Реакцию останавливают 15-минутным кипячением на водяной бане. Редуцирующие сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона.

Арабиназная активность.

К 5 мг арабинана добавляют 1 мл 0,1 ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска иммобилизованного фермента ;5 мг. Инкубация 30 мин при 4-0°С, Реакцию останавливают 15-минутнь1М ки:пячением на водяной бане. Редуцирующие сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона,

Галактаназная активность.

К 5 мг галактана (из белого люцина) добавляют 1 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска И1и№1обилизованного фермента 5 мг. Инкубация 30 мин при-40с. Реакцию останавливают 15-минутным кипячением на ifoaaной бане. Редуциру о|дие сахара определяют по методу Сомоги-Нельсона.

Маннаназная активность.

К 5 мг галактоманнана (из семян ;люцерны) добавляют 1 мл 0,1 И ацетатного буфера, рН 4,2. Навеска иммобилизованного фермента 5 мг« Инкубгщия 30 мин при .-Реакцию останавливают 15-минутным кипяченией на водяаОй бане. Редуцирукяцие сахара определяют п-о методу Сомоги-НельсонаЗа единицу активности принимеиот такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль эквивалента ксилозы за 1 мин при данных условиях. Технико-эконокшческий эффект преД лагаемого изобретения заключается в экономии и комплексном испольэо 9ании ферментного препарата, т.е. в связывании четырех компонентов с высоким выходом, а также в повышении выхода ксилоназы.

Высокие показатели всех актицносfей иммобилизованной гемицеллюлаэы . являются предпосылкой практического использования иммобилизованного препарата.

5 10557706

Иммобилизованный препарат теми-использованы в качестве источника

целлюлаэы можно применять для осаха-.углеводородов для выращивания корривания растительных отходов, вмовЫх дрожжейf в микробиологической

частности для осахаривания водораст-промышленности. Ксилоза легко может

воримых олигосахаридов - отходов пробыть превращена в ксилит и Фурфурол,

изводства целлюлозы, с получением широко применяемые в фармацевтическсилозы, арабинозы и маннозы. Этикой и химической промышленносмоносахариды в дальнейшем могут бытьти.

ПОЛУЧгаМЯ ИГОЮБИЛИЭОВАННОГО ГБЮЩЕЯЛЮЛАЗНОГО КЭМПЛЕКСА путед4 ковгшентного связывания ферментного препарата с HepacitBOpHhAM носнтеле, о т л я ч а ю ц и и с я тем/ что, с целью повышения выхода целевого продукта и комплексного использования исходного сырья, и польч зупт ферментный препарат AsperglCtuS higer 15, содержащий ксиланазу,арабиигиэу, галАктаназу и маннаназу, а в качестве носителя используют бензохйноновый силохром при соот- .:НОй1еиии носитель:фермент - lt