Способ получения бактериальногофЕРМЕНТНОгО пРЕпАРАТА МАцЕРиРующЕгОдЕйСТВия Советский патент 1981 года по МПК C12N9/06 

I

Изобретение относится к микробиологической промышленности, производящей бактериальные и ферментные препараты, и может быть использовано в промышленности первичной обработки лубоволокнистых культур и сельском хозяйстве для облагораживания грубых кормов .о

Известен способ получения ферментных препаратов с высоким содержанием транс-элиминазы пектиновой кислоты, обладаюгцих повышенной способностью к деструкции растительных материалов И

Для получения этих препаратов проводят культивирование us ро1iтуха при 28С в течение 7-50 ч в зависимости ОТ емкости реакционного сосуда питательной среды, перед Засевом ДОВОДЯТ до значения 6,5-7,0. Культуру выращивают в колбах Эрлёнмейера на качал1Г«ис при 200 об/мин или в ферментерах с режимом аэрации 0,5-0,85 (объем воздуха/объем среды в мин). АКТИВНОСТЬ трансэлиминазы пектовой КИСЛОТЫ в культуральной жидкости 1500-4500 ед/мл (за единицу активности фермента принимается такое его количество, которое вызывает в условиях реакции увеличение экстинкции на 0,1 за 10 мин). АКТИВНОСТЬ onределяется прямым спектромвтрированием при длине волны 235 нм.

К недостаткам способа относится большая продолжительность культивирования продуцента, а также наличие целлюлозы в ферментативном комплексе препарата, что значительно снижает крепость технологического льноволокна при применении препарата в npohftBU0ленности первичной обработки льна.

Известен также способ получения пектолитнчеекого 5ферментного препарата f 2 .

Для получения ферментного препарата культивируют анаэробный микроорганизм Clostrldium felstneum 22 при 37 С в течение 48 ч на среде, содержащей в качестве источника углерода декст ин.

К недостаткам способа относятся

0 высокая СТОИМОСТЬ и Дефицитность ис точника углерода в питательной ере-, де, а также значительная продолжительность процесса культивирования 5 продуцента.

Наиболее близким к предлагаемому способ получения бактериального ферментного препарата мацерирующего действия предусматривает вырадивание анаэробной культуры Clostridium pectl,nofеrmentans 15 при ЗО-С в течение 36-48 ч с дальнейшей фильтрацией культур ьной жидкости на барабанном вакуум-фильтре с применением микрози ла, упариванием в вакууме и концентрированием методом осаждения ацетоном или распылительным высушиванием на сушилке типа Niro Atomfzer. Пек тин-транс-элиминазную активность определяли по увеличению оптической плотности при длине волны 235 нм. При этом за единицу активносзти фермента принималось такое его количество, которое вызывало увеличение оптической плотности на 0,555 за 1 ч в условиях реакции. К концу культивирования в культуральной жидкости накапливалось 0,6 ед/мл пектин-транс -элиминаэы. Для удаления воздуха при выращивании строгхэ анаэробного продуцента Clostridium pectinofermentans 15 питательную среду после стерилизации дополнительно выдерживают при в течение 30 мин. После этого среду быстро охлаждают и засевают посевным материалом. Затем добавляют стериль.ную смесь парафина и вазелина (1:1) для образования пленки, защищающей культуральную жидкость от воздуха незаполненной части ферментера. Все операции по передавливанию компонентов питательной среды в ферментор и охлаждению ее после стерилизации производятся стерильным инер ным газом, что позволяет избежать ко такта с кислородом воздуха Все меры по созданию строго анаэробных условий культивирования продуцента услож няют технологию и повышают стоимость конечно1чэ продукта. Кроме того, в фе ментативном комплексе препарат.а, пол ченного данным способом, отсутствуют гидролитические и лиазные ферменты эндо-действия, активность пектин-транс-злиьшназы недостаточно высока Цель изобретения - повыиение активности пектин-транс-элиминазы и ра ширение ферментативного комплекса препарата. Поставленная цель достигается тем что в качестве продуцента используют факультативно-анаэробный микроорганизм Bacillus circulans 31, а выра щивание проводят в течение 20-24 ч при температуре 37-42с, причем рН питательной среды перед посевом доводите до 8,0-8,4. . Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Питательная среда стерилизуется при 1 ати в течение 1 ч, охлаждается до , значение рН доводится до 8,0-8,4 стерильным раствором концент рированной щелочи и засевается посев ным материалом в количестве 5%. Для равномерного распределения культуры четыре раза в сутки -на 3-5 мин вклюается мешалка при низких числах обортов. Выращивается продуцент при емпературе 37-42°с в течение 20 4 ч . К этому времени заканчивается огарифмическая стадия равития кульуры и в культуральной жидкости наапливается максимальное количество ерментов, отвечающих за мацерацию астительной ткани. По окончании проесса выращивания культуральную жидкость фильтруют на барабанном вакуумфильтре с применением перлита, коаентрируют на вакуум-выпарной устаовке при до содержания сухих еществ 1.2 Б, затем в концентрат доавляют 0,1% CaGla и 12% NaCl и сушат на распылительной сушилке при следущем режиме: Т .,„ 130-135с, Тв, 60-65 с. П р и м е р 1. Bacillus clrculans 31 выращивают в ферментере емкостью 250 л.. Объем питательной среды 100 л, ее состав в процентах следующий: свекловичный жом - 2; СаСО - 0,5; {NH4)2HPq4 - 0,75; - 0,1} кукурузный экстракт - 0,5. Питательную среду стерилизуют при 1 ати в течение 1 ч. Затем среду охлаждают до , значение рН доводят до 8,0 стерильным раствором конпентрированиой щелочи и засевают посевным материалом в количестве 5%. Культивируют продуцент при температуре в течение 24 ч без подачи воздуха. В культуральной жидкости по окончании процесса культивирования определяются активности следуккдах Лерментов: пектин-транс-элиминазы (прямое спектрофотометрирование по дпике волны 235 HMf за единицу активности принй-мается такое количество фермента, которое катализирует расщепление субстрата до образования 1 ммоля дигалактуроновой кислоты. Коэффициент молярной экстинкции принимается равным 4800 моль ) , эндо-полигалактуроназы {вискозиметрическим методом), экзо-полигалактуроназы (по увеличению количества восстанавливающих альдегидных групп титрометрическим методом). Определение активностей ферментов в культуральной.жидкости дало следующее результаты, ед/мл: Пектин-транс- элиминазы 1,5 Эндо-полигалактуроназа 1,5 Экзо-полигалактуроназа; 3,4 Культуральную жидкость подают на фильтрацию для отделения биомассы и нерастворимых остатков питательной среды. Фильтрат культуральной жидкОс- ти концентрируют при на вакуумвыпарной установке до содержания сухих веществ 11,. К концентрату добавляют 0,1% CaCli и 11,5% NaCl ивысушивают на распылительной сушилке. Выход ферментного препарата Мацеробациллин ГЗх составляет 4 кг со 100 л культуральной жидкости.

Пример 2. Bacillus clrculans 31 выращивают в 3-х литровых колбах. Состав питательной среды и режим стерилизации те же, что и в примере 1. рН после стерилизации доводят до значения 8,2 и засевают посевным материалом в количестве 5%. Выращивают продупент при 40®С в течение 22 ч. В культуральной жидкости определяют активности ферментов, ед/мл:

.Пектин-транс-элиминаза 2,0 Эндо-пс шгалактуроназа 2,3 Экзо-полигалактуроназа 3,8 П р и мер 3. bacillus ctrculans 31 выращивают в 3-х литровых колбах, и Состав питательной среды и режим стерилизации те же, что и в примере 1. рН после стерилизации доводят до значения 8,4 и засевают посевным материалом в количестве 5%. Культивирование проводят при температуре в течение 20 ч. В культуральной жидкости определяют активности Аерментов, ед/мл:

Пектин-транс-элиминаза 1,7 . Эндо-полигалактуроназа 1,8 Экзо-полигалактуроназа 3,2

Формула изобретения Способ получения бактериального ферментного препарата мацерирующего

действия, заключакяцийся в выращивании продуцента глубинным методом, фильтрации культуральной жидкости и распылительном высушивании сконцентрированного фильтрата культуральвой жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности пёктин-транс-элиминазы и расширения ферментативного комплекса препарата, в качестве продуцента используют факультативно-анаэробOный микроорганизм Bacillus ctrculans № 31, а вырёШ1ивание проводят в течение 20-24 ч при температуре 37-42 0, причем рН питательной среды перед посевом доводят до значения 8,0-8,4

5

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Заявка ФРГ 2054948, 1973.

2.Авторское свидетельство СССР 20 622838, 1978..

3. Бравова Г. Б. и др. Технология культивирования анаэробных бактерий рода Clostftdlum - продуцентов пекто,литических ферментных препаратов.

5Сб.ферменты. Получение и применение в народном хозяйстве, Труды ВНИИсинтезбелок Вып.. 2, М., 1974,