Питательная среда для культивирования продуцента мацерирующих ферментов @ @ -31 Советский патент 1984 года по МПК C12N1/20 C12N9/00 C12R1/07 

Изобретение относится к микробио рогической .промьпиленности и может Ьыть использовано при производстве мацерирукщих ферментов, применяемых в первичной обработке лубоволокнистых культур, например льна и конопли. Известна питательная среда для биосинтеза пектолитических ферментов .анаэробной бактерии Clostrldium pectinofermentans 15 в процессе ее глубинного культивирования СП. АКТИВНОСТЬ пектат-транс-элиминазы (ПТЭ) на этой среде составляет 0,6-1,0 ед/см, эндо-полигалактурон за (эндо-ПГ) не синтезируется. Недостатком этой питательнрй сре ды является низкий уровень ПТЭ и от сутствие синтеза эндо-ПГ. Известна питательная среда для глубинного культивирования продУЬен тов пектолитических ферментов. Активность ПТЭ при культивировании B.circulans-31 в анаэробных условия «а 30-м часу культивирования состав ляет 16.4 ед/см, эндо-ПГ .6 ед/см 2J. Недостатками указанной питательной среды являются низкий уровень биосинтеза пектолитических ферментов и значительное время культивирования , Известна также питательная среда для культивирования микроорганизмов - продуцентов пектинолитичес ких ферментов, содержащая оксигенированное соединение кобальта с азот содержащим лигандом, добавление которого приводит к увеличению активности ферментов З. Наиболее близкой к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному, эффекту является питательная среда для биосинтеза мадерйругацих ферментов, содержащая: щелочной гидролизат свекловичного жома 50 г. 2,6-8%-ного раствора, ку курузный экстракт 0,4-2,0; мочевина 0,3-1; кальций углекислый 0,05-0,5; калий сернокислый 0,05-0,3; вода водопроводная остальное. Максимальная активность пектаттранс-элиминазы на питательной среде указанного состава составляет .60 ед/см 4 . Однако данная питательная среда имеет недостаточно высокий уровень синтеза ПТЭ - фермента, ответственного за мацерацию растительной ткани. В составе питательной среды используется щелочной гидролизат свекловичного жома, для приготовления которого необходимы дополнитель ные операции по проведению гидроли.эа, что значительно удлиняет процесс приготовления питательной среды. Цель изобретения - повышение биосинтеза, увеличение стабильности ПТЭ и снижение себестоимости. Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду для культивирования продуцента мацерирующих ферментов Bacillus circulans-31, содержащую кукурузный экстракт по сухим веществам, углекислый кальций, мочевину, сернокислый калий, свекловичный жом и водопроводную воду, дополнительно вводят оксигенальное комплексное соединение кобальта (П) с углеродсодержащим лигандом, гидроокись калия и сернокислый марганец при следующем соотношении ингредиентов , мае.%: Свекловичный жом 1-4 Сернокислый калий 0,1-0,3 Углекислый кальций 0,02-0,3 Мочевина0,2-0,8 Кукурузный экстракт , при содержании сухих веществ 40-50%0,2-1,5 Сернокислый марганец 0,02-0,12 Гидроокись калия 0,1-0,3 Оксигенальное комплексное соединение кобальта (II) с углеродсодерхащим лигандом0,00030,0042 (по металлу) Вода водопроводная Остальное Применение оксигенального комплексного соединения кобальта (U) с углеродсодержащим лигандом в составе питательной среды приводит к интенсификации биосинтеза мацерирующих ферментов, увеличению роста биомассы и снижению себестоимости конечного продукта при глубинном аэробном культивировании В.circulans-31 - продуцента мацерирующих ферментов вследствие того, что оксигенальное координационное соединение является источником кислорода, так как молекулярный кислород в координационном соединении находится в слабосвязанном состоянии; молекула координационного соединения содержит кобальт, являющийся микроэлементом, необходимым для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов; углеродсодержащий лиганд является дополнительным-источником углерода; в оксигенальном координационном соединении имеются лабильные координированные молекулы воды, которые способны к замещению на другие лиганды, например на донорные атомы азота белков.ых молекул, аминокислот и т.д., входящих, в состав микроорганизмов, что приводит к образованию активного комплекса микроорганизм - координационное, соединение кобальта. Эта система является активатором процесса ферментации-.

В отличие от прототипа в предлагаемой питательной среде в качестве источника углерода используется свеловичный жом, для гидролиза которог в состав среды дополнительно вносят гидролизукадий агент - гидроокись калия, которая одновременно является дополнительным источником калия. Гидролиз свекловичного жома, под действием гидроокиси калия проходит в момент стерилизации питательной среды, что исключает дополнительные операции по приготовлению щелочных гидролизатов.

В предлагаемой питательной среде используют сернокислый марганец как источник марганца и стабилизатора ПТЭ. .

Культивирование B.circulans-31 во всех примерах проводили в колбах емкостью 0,8 л, К заполнения 0,4, при температуре 40°С и аэрации на качалке 180 об/мин, доза посевного материала 5%, в течение 10-18 ч.

Пример 1. Предлагаемая среда, мас.%:

.Свекловичный жом 1

Гидроокись калия0,1

Углекислый кальций 0,02

Мочевина. 0,2

Кукурузный экстракт при

содержании сухих веществ

40-50%0,2

Сернокислый марганец 0,02

Оксигенальное соединение

кобальта (И) с углеродсодержаиим лигандом имидазолом0,000

(по. металлу)

Вода водопроводная Остальное

Активность ПТЭ к 14 ч роста в культуральной жидкости достигла 640 ед/см (активность ПТЭ определяли, прямым спектрофотометрированием при длине волны 230-235 нм; за единицу активности принимается такое количество фермента, которое катализирует расщепление субстрата до образования 1 ммоля дигалактуроновой кислоты), активность экзо-полигалактуроназы (экзо-ПГ) достигла 58 ед/см (активность экзо-ПГ определяли титрометрическим методом по увеличению количества восстанавливающих альдегидных групп (ГОСТ 20264,3-81); активность эндо-ПГ достигла 2 ед/см (активность эндо-ПГ определяли вискозиметрйческим методом ГОСТ 20264,3-81); титр клеток составил 2,710 (титр клеток определяли методом предельных разведений) .

П р и м е р 2, Предлагаемая среда , мае, %:

Свекловичный жом 2,75 Гидроокись калия 0,2 Сернокислый калий 0,2 Углекислый кальций 0,25 Мочевина0,5

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50%.1,25

Сернокислый марганец 0,1 Оксигенальное соединение кобальта с лигандом - имидазолом 0,0024

(по металлу)

Вода водопроводная Остальное АКТИВНОСТЬ ПТЭ к 10-му часу культивирования достигла 890 ед/см, экзо-ПГ - 71 ед/см, эндо-ПГ 5 ед/см, титр клеток 1,8 10.

Приме рЗ. Предлагаемая среда, мас.%:

Свекловичный жом 4 Гидроокись калия 0,3 Сернокислый кальций 0,4 Углекислый калий Мочевина0,8

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50%1,5

Сернокислый марганец 0,12 Оксигенальное соедйнение кобальта с лигандом - имидазолом 0,0042

(по ме таллу)

Вода водопроводная Остальное ПТЭ на 16-ом часу культивирования, достигла 670 ед/см экзо-ПГ 80 ед/см эндо-ПГ-3 ед/см, титр клеток 1,2x10,

П р и м е р 4, Предлагаемая среда , мае.%:

Свекловичный жом1

Гидроокись калия 0,1 Углекислый кальций 0,02 Мочевина0,2

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50%0,2

Сернокислый марганец 0,02 Оксигенальное соединение кобальта с лигандом- этилендиамином 0,0003 (по металлу)

Вода водопроводная Остальное, ПТЭ на 18-ом часу культивирования достигла 652 ед/см, экзо-ПГ 51 ед/см, эндо-ПГ - 3 ед/см , титр клеток 1,3 10.

При определении стабильности ПТЭ, полученной в результате культивирования B.circulas З на предлагаемой

питательной среде, проведено определение активности ПТЭ после 1-4 сут хранения культуральной жидкости при комнатной температуре. Контролем служила культуральная жидкость, полученная на питательной среда прототщ1а. В контрольном опыте получены следуюцие.результаты: после 1-х суток хранения культуральной жидкости падения ПТЭ не отмечено; на 2-е сутки падение ПТЭ активности на 20%; на .3-й сутки падение ПТЭ активности на 27%; на 4-е сутки падение ПТЭ активности на 42%.

:П р и м е р 5. Состав среды аналогичен составу среды примера 1. Hoqjie 2-х сут хранения культуральной жидкости изменения ПТЭ активности не отмечено, на 3-й сутки падение активности ПТЭ на 10%; на 4-е сутки на:17%.

Пример 6. Состав среды аналогичен составу среды примера 2, После 2 сут хранения культуральной жидкости изменение ПТЭ активности не отмечено; на 3-й сутки падение активности на 5%; на 4-е сутки - на 8%.

.Пример, Состав среды ана-логичен состау среды примера 3. После 2-х суток хранения культуральной жидкости изменение ПТЭ активности не отмечено, на 3-й сутки падение активности на 6%, на 4-е сутки на ll%k

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования

B.circulans-31 - продуцента мацери- , руквдих ферментов имеет по сравнению с прототипом следующие преимущества: увеличение ПТЭ активности в культуральной жидкости в 10-15 раз; достижение активности экзо-ПГ до 60-80 ед/см ; достижение активности зндоПГ до 3-8 ед/см ; увеличение роста биомассы - титр клеток достигает до 1,8-10; повышение стабильности

ПТЭ в 2-3 раза, что приводит к снижению себестоимости конечного продукта на 1761,0 руб.

В качестве базового объекта принята питательная среда для прризводства мацерирующего; ферментного препарата. Мацеробациллнн ГЗх на Омутнинском химзаводе.

Технико-экономические показатели базового объекта: активность ПТЭ 350+50 ед/см ; себестоимость конечного продукта 5653,7 руб.

Технико-экономические показатели предлагаемого технического решения: активность ПТЭ 890 ед/см ; себестоимость конечного продукта 3892,7 руб.

Ожидаемый экономический эффект от применения предлагаемой питательной среды составляет 79,8 тыс.руб.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА МАЦЕРИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ BACILLUS CiRCULANS-31, содержащая кукурузный экстракт по сухим веществам,углекислый кальций, мочевину, сернокислый калий, свекловичный жом, водопроводную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения биосинтеза, увеличения стабильности пектат-трансэминазы и снижения себестоимости,, в состав среды дополнительно вводят оксигенальное комплексное соединение кобальта (Ц) с углеродсодержащим лигандом, гидроокись калия и сернокислый марганец при следующем соотношении ингредиентов, мас.%; Свекловичный жом 1-4 Гидроокись калия 0,1-0,3 Сернокислый калий 0,1-0,4 Углекислый кальций 0,02-0,3 Мочевина0,2-0,8 (Л Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50% 0,2-1,5 Сернокислый марганец 0,02-0,12 Оксигенальное комплексное соединение кобальта (И) с углеродсодержащим лиган-J дом 0,00030,0042 (по металлу) 9) Вода водопроводная Остальное О :д 00