Питательная среда для выращивания спорового посевного материала бактерий рода BocILLUS - продуцентов гидролитических ферментов Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промьшшен- ности и может быть использовано при производстве ферментных препаратов при глубинном культивировании микроорга- низмов, например, Вас. subtilis 72 и Вас. circulans 31.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы и увеличение продуктивности выращиваемых культур Bacillus subtilis 72 и Bacillus circulans 31.

Изобретение заключается в том, что питательная среда, содержащая марганец сернокислый и аммоний хлористый.

дополнительно содержит саго искусственное, как источник углерода, азота и фосфора при следующих соотношениях ингредиентов, г/дмз: саго искусственное 400-600; марганец серно- кисльш 0,1-1,0; аммоний хлористый 0,1-1,0, вода водопроводная остальное.

Саго искусственное получают из

картофельного и кукурузного крахмала высшего и первого сортов. Цена 1 кг

.саго искусственного 0,60 руб.

Пример 1. Среда для выращивания спорового посевного материала Вас. subtilis 72 продуцента щелочной

СР

сл

00 О5

со

3149

протеазы и Вас. circtilans 31 - продуцента мацириругощнх ферментов, г/дм. Саго искусственное 400,0 Марганец сернокисльш 0,1 Аммоний хлористый . . Вода водопроводная Остальное Среду стерилизуют 1 ч при 1 ати. Для продуцента щелочной протеазы продуцент выращивают на данной среде при 37 С в колбах емкостью 0,75 дм при объеме питательной среды 0,1 дм в течение 3 сут. Для культивирования применяют посевной материал, получен- ньш вьфащиванием культуры на МПБ в течение 24 ч на качалке и засевают для получения спорового посевного материала в количестве 5%, Протеолити- ческая активность через 1-3 сут 10000 ед/см . Условия культивирования во всех опытах аналогичны. Отличие

. -

опытов заключается в процентном держании компонентов питательной среды.

Протеолитическая активность харак- теризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и вьфажается числом единиц протеазы в 1 г препарата.

За единицу протеолитической актив- ности принимается такое количество ферментаJ которое катализирует гидролиз 1 г белка (казеина) при расщеплении его 30% в принятых условиях: температура 40°С, рН реакционной ереды 10,5, время гидролиза 60 мин.

Метод основан на колориметрическом определении продуктов гидролиза белка с применением фенольного реактива Фолина.

Динамика изменения активности посевного материала на данной среде з. процессе хранения представлена в табл.1, .

Для продуцента мацерирующих фер- ментов: продуцент выращивают на данной среде в течение 8 сут в аналогичных условиях. Активность посевного ма материала через 3 сут составляет: петат-транс-эмилаза ,(ПТЭ) 2500 ед/CM эндо-ПГ 12 ед/см ; экзо-ПГ 1,5ед/см

Активность ПТЭ характеризует способность фермента катализировать расщепление о6-1,4-связи низкометокси- лированного пектина с образованием продуктов с ненасыщенными связями между 4 и 5 атомами углерода. За единицу активности ПТЭ принято такое количество фермента, которое за 1 ч при

катализирует расщепление пектина с образованием ненасьт(енных продуктов реакции, в результате чего происходит увеличение оптической плотности реакционной смеси на 0,1,

Метод основан на спектрофотометри- ческом определении продуктов реакции с ненасыщенной двойной связью между 4 и 5 атомами углерода, имеющих максимальное поглощение при длине волны 230-235 им.

Активности эндо-ПГ и экзо-ПГ определяют в соответствии с ГОСТом.

Количество биомассы через 3 сут 1,2 1П °.

Количество биомассы определяют по массе сухого, вещества клеток, содержащихся в определенном объеме культуры путем высушивания до постоянной массы и последующего взвешивания.

Динамика определения активности посевного материал Вар. circulans 31 на данной среде в процессе хранения представлена в табл«2.

Пример 2. Предлагаемая среда, г/дмз :

Саго искусственное 500,0

Марганец сернокислый 0,5

Аммоний хлористый0,5

Вода водопроводная Остально

Для продуцента щелочной протеазы, Вас. subtilis 72 после 3 сут выращивания Протеолитическая активность посевного материала 16500 ед/см , а на среде протеине 15500 ед/см .

Динамика изменения протеолитической активности в процессе хранения посевного материала представлена в табл.3.

Для продуцента щелочной протеазы Вас. subtilis 72,

Через 3 сут выращивания Протеолитическая активность посевного мате- . риала 12000 ед/см.

Динамика изменения протеолитической активности в процессе хранения посевного материала представлена в табл.6.

Для продуцента ферментов Вас. cir- culans 31 через 3 сут выращивания на данной среде активность посевного материала составила: ПТЭ 3550 ед/см ; эндо-ПГ 12 ед/см ; экзо-ПГ 2,7 ед/см

Количество биомассы 1,410 .

Динамика изменения активности посевного материала Вас. circulans 31 на среде в процессе хранения представлена в табл.7.

51Д9

Для продуцента мацерирующих фер-.- ментов Вас. circulans 31 через 8 сут вьгращивания на данной среде актив-- ность представлена в табл.4.

Количество биомассы 1, . Динамика изменения активности посевного материала Вас. circulans 31 -В процессе хранения представт ена в табл.5.

ер 3. Предлагаемая сре600,0 1,0 1,0 Остальное

20

Прим да, г/дм :

Саго искусственное Марганец сернокислый Аммоний хлористьй Вода водопроводная

Пример 4. При варьировании содержания саго искусственного от 200 до 800% получены результаты, из которых видно, что выход за предельные значения выбранных нами оптимальных собтношений не приводит к повышению вьгхода биомассы и увеличению продуктивности используемых культур.

Данные представлены в табл.8.

Преимущество предлагаемой среды заключается в том, что введение в качестве органического углерода, азота и фосфора саго искусственного, а в качест-30 ве минерального источника азота - ам- мония хлористого ведет к улучшению качества посевного материала на 15 20%, увеличению срока хранения посев- ного материала на 10-15%, снижению - трудоемкости процесса за счет сокраения числа компонентов питательной среды.

25

Таблица

Возраст, сут

Протеолитическая активность, %

Таблица 2

Возраст, сут

ПТЭ

Активность, %

1.Э1У10-ПГ...1 100 98 96 80 75 70

2LK3pJ nil. 100 102 101

95

93

85

20

Таблица 3

25

Таблица 4

Питательная среда для выращивания спорового посевного материала бактерий рода BACILLUS - продуцентов гидролитических ферментов, содержащая органический источник углерода, минеральный источник азота и фосфора, марганец сернокислый и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода биомассы и увеличения продуктивности выращиваемых культур, она содержит в качестве органического источника углерода, азота и фосфора саго искусственное, а в качестве минерального источника азота аммоний хлористый при следующем соотношении ингредиентов, г/дм³: Саго искусственное - 400 ÷ 600, Марганец сернокислый - 0,1 ÷ 1,0, Аммоний хлористый - 0,1 ÷ 1,0, Вода водопроводная Остальное.

Таблица 5

100 100 98 94 78 60

100

105

108

97

96

90

100

101

100

85

80

60

Таблица 7

Таблица