Способ определения лизосомолабили-зиРующЕгО дЕйСТВия ВЕщЕСТВ Советский патент 1981 года по МПК C12Q1/44 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии.

Известен способ определения лизосомолабилизирующего действия веществ путем введения их животным с последующим исследованием гидролаз в печени 1.

Однако известный способ недостаточно точен и длителен.

Целью изобретения является повыщение точности способа и ускорение его.

Эта цель достигается тем, что исследуют распределение хлорацетатэстеразы и появлении ее в перибиллиарных зонах определяют лизосомолабилизирующее действие веществ.

Способ осуществляют следующим образом. Подбирают молодых, однотипных, здоровых животных, так как любое инфекционное или паразитарное заболевание может спровоцировать неспецифическую активацию лизосомного аппарата клеток, предшествующую некробиотическим изменениям в гепатоцитах.

Испытуемые вещества (например, твин-60, тритон ВР 1339, тритон х-100 и т. д.) опытным животным вводят парэнтерально. Дозы выбирают в зависимости от токсических свойств препарата и ожидаемого лизосомолабилизирующего эффекта, обычно в интервале концентраций ,

10- М, в пересчете на живой вес животных (при использовании низкомолекулярных соединений). Через 24-48 ч опытных животных (в

группе по три животных) под легким эфирным наркозом обезглавливают, извлекают печень и кусочки последней размером 1X1 см замораживают в жидком азоте или в криостате.

Криостатные срезы изготавливают при - 15°С, толщиной 15-20 мкм. Срезы расправляют на предметных стеклах и подсушивают при комнатной температуре 15- 30 мин.

Криостатные срезы печени фиксируют в парах формалина при комнатной температуре в течение 15 мин.

Проводят гистохимическую реакцию на хлорацетатэстеразу. Данная реакция наиболее четко показывает лабилизацию лизосомной мембраны, что выражается в четком увеличении активности фермента в перибилиарных областях гепатоцитов.

Состав инкубационной среды: 20 мг нафтол А-Д-хлорацетат растворяют в 1 мл

диметилформамида, добавляют 25-30 мл

фосфорного буфера рН 5,5 мл и 20 мг

прочного синего ББ.

Если в срезах имеются ферменты хлорацетатэстеразы (эластаза и др.), то субстрат нафтол А-Д-хлорацетат расщепляется, и нафтол А-Д-, связываясь с краской - прочный синий ББ, дает синюю зернистость.

Продолжительность инкубации при температуре 37°С в термостате в течение 30- 90 мин.

Препараты заключают в глицерин-желатину и изучают на световом микроскопе. В участках лабилизации лизосомного аппарата обильно отлагаются синие гранулы, преимущественно в перибилиарных областях гепатоцитов.

Степень лабилизации лизосомного аппарата в перибилиарных областях гепатоцитов оценивают полуколнчественно по следующим четырем ступеням:

1- в перибиллиарных областях гепатоцитов активность хлорацетатэстеразы не обнаруживается или слабая положительная реакция на данный фермент выявляется до 5% гепатоцитов. Такая картина обнаруживается в нормальной печени и при отсутствии лизосомотропного эффекта у испытуемого вещества;

2- четкое увеличение активности хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях обнаруживается до 25-30% гепатоцитов;

3- четкое увеличение активности хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях гепатоцитов обнаруживается у 50-60% гепатоцитов;

4- высокая активность хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях обнаруживается более чем у гепатодитов.

По данной шкале полуколичественно может быть оценен лизосомотропный эффект любого испытуемого вещества в зависимости от его дозы, способа введения, сроков действия и т. д.

Предлагаемый способ обеспечивает быстрое определение, ответ может быть получен уже в течение 1-2 ч после убоя животных, обеспечивает высокую точность и позволяет в короткие сроки обследовать большое количество веществ на предполагаемый лизосомолабилизирующий эффект.

Способ позволяет в физиологических условиях провести отбор малотоксичных и высокоактивных лизосомолабилизирующих веществ, способных модифицировать функции лизосомного аппарата клеток в норме и патологии.

Формула изобретения

Способ определения лизосомолабилизирующего действия веществ путем введения их животным с последующим исследованием гидролаз в печени, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и ускорения его, исследуют распределение хлорацетатэстеразы и при появлении ее перибиллиарных зонах определяют лизосомолабилизирующее действие веществ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Покровский А. А. и Тутельян В. А. Лизосомы. М., 1976, с. 226-243.