Способ определения фазового сос-ТОяНия ВНуТРиКлЕТОчНОй ВОды Советский патент 1981 года по МПК G01N24/10 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗОВОЮ СОСТОЯНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ВОДЫ Указанная цель достигается тем, что в способе определения фазового состояния внутриклеточной воды, основан - кого на охлаждении биологического образца и последующего анализа состояния воды внутри клетки, исследуе Kiyro взвесь клеток вводят в воднйй раст вор, содержащий нминоксильньгй радикал кбнценграцйей; и парамапвитную соль концентрацией I- 2 М, после чего по мере охлаждения регистри руют спектр ЭПР иминоксильногб I радикала, проникшего внутрь клетки, по . L ввду которого судят о фазовом состоянии внутриклеточной воды. На фиг. 1-5 изображены спектры ЭПР, наблюдаемые в процессе осуществления способа. Способ осуществляют следующим образом. . В стекляннук ампулу, вводят ОД1,О мл водного раствора иминоксильного радикала концентрацией 21О М и на радиоспектрюметре наблюдают сигна ЭПР (фиг. I). Затем в ампулу добавляю 0,1-1,0 мл водного раствора парамагнит ной соли, концентрацией 1-2 М, В резул тате обменно1 э взаимодействия сигнал ЗПР от минимального радикала полность уширяется и исчезает (фиг.2) Затем в ампулу вводят 0,8-8,0 мл взвеси биологического объекта, разведенной физиологическим раствором (1:5), и наблюдаю сигнал ЭПР от радикалов, проникающих внутрь клетки (фнг.З). Парамагнитные ионы в норме биологическую мембрану не -проникают, что позволяет следить за сигналом ЭПР радикалов в цитоплазме клетки. Затем раствор охлаждают со скбрбстью 3-5 мин и наблюдаю спектр ЭПР. Ццд н форма линии спектра ЭПР имин ксильного радикала зависит от характера и скорости вращательной ди})фузии радикала в растворителе, которая резко меняется при переходе и;з жидкой фазы в твердую в случае замерзания раствора. Причем спектры ЭПР радикала внутри клетки различны,- в зависимости от того, кристаллическое или стеклообразное состояние твердой фазы внутри клетки. В первом случае кристаллы льда вытесняют радикалы друг к другу и сигнал ЭПР представляет широкую лднию (синглет) (фиг.4). В случае стеклообразного состо ния при замораживании радикалы равномерно распределены в объеме внутри кл ки и спектр ЭПР имеет вид, показанный . на фиг. 5. . 12 П р и М е р. В стекланную ампулу вводят О,1 мл водного раствора иглинозксильного радикала концентрацией . и на радиоспектрометре й&блюдают сигнал ЭПР (фиг. I). Затем в ампулу добавляют О,1 мл водного раствора парамагнитной соли NCE. концентрацией I М. После исчезновения сигнала ЭПР от ими- ноксильного радикала (фиг.2) в ампулу добавляют О,8 мл взвеси фибробластов, разведенной физиологическим раствором (1;5) и наблюдают сигнал ЭПР от радикалов, проникших внутрь клетки (фиг.З), Затем взвесь фибробластов с введенными внутрь цитоплазмы радикалами охлаждают со скоростью 3 С/мин и наблюдают спектры ЭПР радикалов внутри клетки через каждые . При - 45 С (температура кристаллизещии) во взвеси фиб- робластов появляется сигнал ЭПР, ха.рактеризуюший кристаллическое состояние воды внутри клетки (фиг.4). Таким образом, данный способ позволяет однозначно определить стеклообразное и кристаллическое состояние воды внутри клетки в процессе низкотемпера- турного консервирования, не повреждая при этом ее структуры, что дает дополнительную информацию при разработке новых способов низкотемпературного консервирования биологических объектов. Формула изобретения Способ определения фазового состоянтя внутриклеточной воды, основанный на охлаждении биологического образца и последующего анализа состояния Ьоды внутри клетки, отличают й- с я тем, что, с целью повышения точности определения, исследуемую взвесь клеток вводят в водный раствор, содержащий иминоксильный радикал концентрацией 1О -2 Ю М и парамагнитную соль концентрацией 1-2 М, после чего по мере охлаждения регистрируют спектр ЭПР иминоксильного радикала, проникшего, внутрь клетки, по виду которого судят о фазовом состоянии внутриклеточной воды. Источники информации, принятые во внимание при 1.DiEeer K.3.,G -avaetio Е.е., Hiwtns С.Е ОпгасеееиБаг Freezing in Biomoitet-iae3- Qr:J. obioeoq;:; 9 72, V. 9. p. 429 -440. 2.Bueeivant s. Freeze -etcWn(5 techni-, «jues appQied to bioeo icqe memfai-anes, Pbie. Trans. Roy. soc. {.oHdon, 9 74, V. 6. 2-68, 89-1, p. 5-f4 (ПРОТОТИП).