СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ОСМОТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Советский патент 1995 года по МПК G01N24/10 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для изучения проницаемости мембран эритроцитов для осмотически активных органических веществ.

Цель изобретения упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций.

Способ осуществляют следующим образом.

К суспензии клеток в капилляре, находящемся в резонаторе спектрометра ЭПР при известной температуре, добавляют раствор с такой же температурой, содержащий осмотически активное органическое вещество, радикал 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксил и парамагнитную соль K₃[Fe(CN)₆] до получения концентрации двух последних в суспензии 2˙ 10^-3- 10^-4 моль/л и 0,09-0,11 моль/л cоответственно.

При этом наблюдается спектр ЭПР радикалов, находящихся только в цитозоле клеток, так как парамагнитная соль не проникает в клетку и уширяет спектр радикалов, находящихся вне клеток.

При наличии во внеклеточной среде осмотически активного вещества происходит дегидратация клеток. Если это вещество проникает через мембраны клеток, то происходит их регидратации. В связи с этим повышается концентрация радикала вне клеток и соответственно его химический потенциал. Поэтому радикал входит в клетку вслед за осмотически активным веществом и водой пропорционально их количеству. Это позволяет следить за кинетикой проникновения осмотически активного вещества через мембрану клеток по количеству радикала в цитозоле, зависящего от количества проникающего осмотически активного вещества и воды.

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Эритроциты трехкратно отмывали от лейкоцитов физраствором центрифугированием в течение 20 мин при 3 тыс. об/мин. Затем поместили в капилляр, установленный в резонаторе спектра. После достижения -4^oC прибавили 1: 1 раствор, содержащий 0,10 моль/л K₃[Fe(CN)₆] 5˙ 10^-4 моль/л иминоксильного радикала 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксила и 30% глицерина. После перемешивания снимали спектры ЭПР радикала через каждые 2 мин с момента прибавления раствора.

Затем получали график, построенный путем обработки полученных данных, используя уравнение
ln -kτ где h_к, h_τ интенсивность спектра ЭПР радикала конечная и через время τ соответственно.

Полученное значение константы скорости из графика К 1,3˙ 10^-3c^-1.

П р и м е р 2. Способ осуществляли в соответствии с примером 1, только раствор вместо глицерина содержал 30% 1,2-пропандиола. Полученное значение константы скорости К 3,1 ˙ 10^-3 c^-1.

П р и м е р 3. Способ осуществляли в соответствии с примером 1, только вместо глицерина раствор содержал 30% этиленгликоля.

Полученное значение константы скорости из графика К 2,3 ˙10^-3c^-1.

Из приведенных примеров следует, что способ позволяет определять проницаемости клеточных мембран на одной пробе и не требует центрифугирования, что сокращает время осуществления способа на 50±10 мин и значительно упрощает его.

В связи с тем, что проникновение вещества можно регистрировать вскоре после перемешивания (через 1 мин), способ может быть использован для определения проницаемости клеточных мембран не только для медленно, но и для быстро проникающих веществ.

Изобретение относится к биологии и медицине и касается изучения проницаемости мембран эритроцитов для осмотически активных органических веществ. Цель изобретения - упрощение способа путем сокращения трудоемких операций. Для этого к суспензии клеток в капилляре, находящемся в резонаторе спектрометра ЭПР добавляют раствор, содержащий осмотически активное органическое вещество (ОАВ), радикал 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксил и парамагнитную соль K₃[Fe(CN)₆] до получения концентрации двух последних в суспензии 2·(10^-3-10^-4) моль/л и 0,09 - 0,11 моль/л соответственно. Наблюдают спектр ЭПР радикалов только в цитозоле клеток, т.к. парамагнитная соль не проникает в клетку и уширяет спектр радикалов вне клеток. При наличии во внеклеточной среде ОАВ происходит дегидратация клеток, если это в-во приникает через мембраны клеток, то происходит их регидратация; в связи с этим повышаются конц. радикала вне клеток и его химический потенциал. Поэтому радикал входит в клетку вслед за ОАВ и водой пропорционально их количеству, что позволяет проследить кинетику проникновения ОАВ через мембрану клеток по кол-ву радикала в цитозоле, зависящего от кол-ва проникновения ОАВ и воды.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ОСМОТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ путем введения исследуемого вещества в суспензию эритроцитов, инкубации и последующего определения изменения физико - химического параметра цитозоля, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа трудоемких операций, в среду инкубации дополнительно вводят иминоксильный радикал 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксил в конечной концентрации 2 · 10^-3 10^-4 моль/л и феррицианид калия в конечной концентрации 0,09 0,11 моль/л, затем регистрируют сигнал электронно-парамагнитного резонанса иминоксильного радикала цитозола и по изменению его интенсивности определяют проницаемость.